پروتوکل سنجش پروتئین بردفورد

پروتوکل سنجش پروتئین بردفورد

ملاحظات استفاده

پروتوکل سنجش پروتئین بردفورد
روش برادفورد بسیار سریع است و تقریباً از همان مقدار پروتئین آزمایش لوری استفاده می کند. این روش نسبتاً دقیق است و نمونه هایی که خارج از محدوده هستند می توانند در عرض چند دقیقه دوباره آزمایش شوند. بردفورد برای استفاده عمومی توصیه می شود، به ویژه برای تعیین محتوای پروتئین در فراکسیون های سلولی و ارزیابی غلظت پروتئین برای الکتروفورز ژل.

مواد سنجش شامل معرف رنگ، استاندارد پروتئین می باشد. روش شرح داده شده در زیر برای حجم نمونه 100 میکرولیتر با استفاده از معرف رنگ 5 میلی لیتر است. بسته به کیفیت رنگ، به حدود 5 تا 200 میکروگرم پروتئین حساس است. در روش های سنجش با استفاده از 5 میلی لیتر معرف رنگی که در آزمایشگاه تهیه شده است، محدوده حساس به 5 تا 100 میکروگرم پروتئین نزدیک است. حجم “روش میکروسنج” را که از 1 میلی لیتر کووت استفاده می کند، کاهش دهید.

 

اصول سنجش پروتئین بردفورد

این سنجش بر اساس مشاهده است که حداکثر جذب محلول اسیدی Coomassie Brilliant Blue G-250 هنگام اتصال به پروتئین از 465 نانومتر به 595 نانومتر تغییر می کند. هر دو فعل و انفعالات آبگریز و یونی شکل آنیونی رنگ را تثبیت می کنند و باعث تغییر رنگ قابل مشاهده می شوند. این روش از آنجا که ضریب خاموشی یک محلول پیچیده رنگ آلبومین در محدوده غلظت 10 برابر ثابت است، مفید است.

تجهیزات

علاوه بر تجهیزات مورد نیاز برای جابجایی مایع، یک اسپکتروفتومتر نور مرئی با حداکثر انتقال در منطقه 595 نانومتر، در مرز طیف مرئی (معمولاً نیازی به لامپ یا فیلتر خاصی نیست) مورد نیاز است. ممکن است از شیشه یا پلی استایرن (ارزان) کووت استفاده شود، اما رنگ هر دو را رنگ آمیزی می کند. کووت های یکبار مصرف توصیه می شود.

معرف ها

معرف برادفورد: 100 میلی گرم Coomassie Brilliant Blue G-250 را در 50 میلی لیتر اتانول 95٪ حل کنید، 100 میلی لیتر 85٪ (وزنی/وزنی) اسید فسفریک را اضافه کنید. هنگامی که رنگ کاملاً حل شد، به 1 لیتر رقیق شده و درست قبل از استفاده، با استفاده ازکاغذ Whatman #1 فیلتر کنید.
(اختیاری) NaOH 1 M (برای استفاده در صورتی که نمونه ها به راحتی در معرف رنگی محلول نیستند) استفاده شود. معرف برادفورد باید قهوه ای روشن باشد. ممکن است لازم باشد فیلتراسیون تکرار شود تا واکنشگر از اجزای آبی پاک شود.

سنجش

  • اسپکتروفتومتر را قبل از استفاده گرم کنید.
  • در صورت لزوم ناشناخته ها را رقیق کنید تا بین 5 تا 100 میکروگرم پروتئین در حداقل یک لوله سنجش حاوی 100 میکرولیتر نمونه بدست آورید.
  • در صورت تمایل، حجم مساوی 1 M NaOH به هر نمونه و ورتکس کنید (به نظرات زیر مراجعه کنید). در صورت استفاده از این گزینه ، NaOH را نیز به استانداردها اضافه کنید.
  • استانداردهای حاوی محدوده 5 تا 100 میکروگرم پروتئین (آلبومین یا گاما گلوبولین توصیه می شود) در حجم 100 میکرولیتر تهیه کنید. نحوه تنظیم سنجش برای پیشنهادات مربوط به تنظیم استانداردها را ببینید.
  • 5 میلی لیتر معرف رنگ اضافه کنید و 5 دقیقه انکوبه کنید.
  • میزان جذب را در 595 نانومتر اندازه گیری کنید.

تحلیل و بررسی

یک منحنی استاندارد جذب در مقابل میکروگرم پروتئین تهیه کنید و مقادیر را از منحنی تعیین کنید. در صورت وجود، غلظت نمونه های اصلی را از مقدار پروتئین، حجم/نمونه و ضریب رقت تعیین کنید.

واکنش رنگ در درجه اول با بقایای آرژنین و کمتر با بقایای هیستیدین، ​​لیزین، تیروزین، تریپتوفان و فنیل آلانین واکنش نشان می دهد. بدیهی است که این روش برای پروتئین های پایه یا اسیدی دقت کمتری دارد. روش بردفورد نسبت به آلبومین سرم گاو، بیش از پروتئین های “متوسط” ، تقریباً دو برابر حساس است. ایمونوگلوگین G (IgG – گاما گلوبولین) استاندارد پروتئین ترجیحی است. افزودن 1 M NaOH توسط Stoscheck (1990) پیشنهاد شد تا امکان انحلال پروتئین های غشایی و کاهش تنوع پروتئین به پروتئین در عملکرد رنگ را فراهم کند.

لینک ها مفید:

دیدگاه شما
محصول با موفقیت به سبد خرید اضافه شد.