پروتوکل سنجش پروتئین به روش BCA
پروتوکل سنجش پروتئین به روش BCA
سنجش اسید بی کینکونیک (سنجش BCA)، که به عنوان روش اسمیت نیز شناخته می شود، پس از مخترع آن، پل کی اسمیت در شرکت شیمیایی پیرس. که اکنون بخشی از Thermo Fisher Scientific است، یک روش بیوشیمیایی برای تعیین غلظت کل پروتئین. در محلول (0.5 میکروگرم/میلی لیتر تا 1.5 میلی گرم در میلی لیتر)، شبیه به روش پروتئین لوری، سنجش بردفورد یا معرف بیورت. غلظت کل پروتئین با تغییر رنگ محلول نمونه از سبز به. بنفش متناسب با غلظت پروتئین نشان داده می شود،.که می تواند با استفاده از تکنیک های رنگ سنجی اندازه گیری شود.
محلول BCA حاوی مواد زیر در محلول بسیار قلیایی با pH 11.25 است:
- اسید بی سینکونیک، کربنات سدیم، بی کربنات سدیم، تارتارات سدیم و سولفات مس (II) پنتاهیدرات.
سنجش BCA در درجه اول به دو واکنش متکی است. ابتدا، پیوندهای پپتیدی موجود در پروتئین، یونهای Cu2+ را از سولفات مس (II) به Cu1+ (واکنش وابسته به دما) کاهش می دهد. مقدار Cu2+ کاهش یافته متناسب با میزان پروتئین موجود در محلول است. در مرحله بعد، دو مولکول اسید بی سینکونیک با هر یون Cu1+ کلات می شوند. و یک مجموعه بنفش رنگ ایجاد می کنند که نور را در طول موج 562 نانومتر به شدت جذب می کند.
مجتمع بی کینکونیک اسید Cu1+ در نمونه های پروتئینی با وجود سیستئین/سیستین، تیروزین و زنجیره های جانبی تریپتوفان تأثیر می گذارد. در دماهای بالاتر (37 تا 60 درجه سانتی گراد)، پیوندهای پپتیدی به تشکیل کمپلکس واکنش کمک می کنند. روش انکوباسیون در دمای بالاتر به عنوان راهی برای افزایش حساسیت سنجش و در عین حال به حداقل رساندن واریانس های ناشی از ترکیب ناهمگن اسید آمینه توصیه می شود.
مقدار پروتئین موجود در محلول را می توان با اندازه گیری طیف های جذب و مقایسه با محلول های پروتئینی با غلظت شناخته شده تعیین کرد.
تداخل ها و سازگاری در روش BCA
آزمایش BCA به طور کلی تحمل مواد شوینده یونی و غیر یونی مانند NP-40 ، Triton X-100 و مواد دفع کننده مانند اوره و کلرید گوانیدینیوم که تمایل به ایجاد اختلال در سایر سنجش های پروتئین رنگی مانندLowry (جدول 2) دارند را دارد. با این حال ، برخی از معرفها ، مانند اسید اتیلن دی آمینتراستتیک (EDTA) ، با کاهش قندها و لیپیدها، می توانند در آزمایش BCA اختلال ایجاد کنند.
اثرات چنین تداخلاتی را می توان با راهکارهایی مانند کاهش مواد مداخله کننده از طریق دیالیز ، فیلتراسیون ژل یا اگر غلظت پروتئین به اندازه کافی بالا باشد ، با رقیق کردن نمونه، از بین برد. ریچلت و همکاران تعدیل ساده ای را برای روشی ارائه کردند که می تواند منجر به بهبود قابل مشاهده در دقت اندازه گیری شود ، به خصوص برای پروتئین غیر تصفیه شده در محلولهای پیچیده مانند محیط کشت.
آنها با استفاده از سنبله داخلی پروتئین BSA که به هر نمونه اضافه می شود ، از یک فاکتور تصحیح استفاده می کنند. بر اساس مطالعات آنها ، میزان کمی پروتئین BCA را می توان پنج برابر بهبود بخشید ، و دقت کمی سنجی BCA را با رویکردهای گرانتر قابل مقایسه می کند .
یکی دیگر از عواملی که با دقت آزمایش BCA تداخل دارد ، وجود باقیمانده های شیمیایی اصلاح شده در پروتئین است. بردی و مکنوتان تأثیر متیلاسیون لیزیل را در روشهای برادفورد و BCA ارزیابی کردند و دریافتند که برای سنجش BCA ، غلظت پروتئین در نمونه های پروتئین متیله شده به طور مداوم بیش از حد تخمین زده می شود.
Thermo Fisher Pierce نسخه جدیدی از روش پروتئین BCA به نام Pierce ™ BCA Protein Assay Assay – Reducing Agent Compatible را دارد که باعث تحمل دیتیوتیریتول (DTT) ، 2-مرکاپتواتانول (BME) ، TCEP و سایر عوامل کاهش دهنده دی سولفید می شود.
مزایای روش BCA
روش BCA مزایای زیادی دارد. در مقایسه با روش های دیگر، آزمایش BCA یکی از حساس ترین است (می تواند پروتئین ها را در غلظت های کم ug/mL 5 تشخیص دهد). این تنوع کمتر از سایرین (به عنوان مثال ، آزمایش بردفورد) است. و می توان از آن برای اندازه گیری طیف گسترده ای از غلظت پروتئین استفاده کرد.
علاوه بر این، حساسیت آن را می توان با انجام سنجش در حضور نانو حسگرهای پلاسمونی همانطور. که در روش SPR-BCA (سطح پلاسمون رزونانس – BCA) ارائه شده توسط لیو و همکاران افزایش یافته است. با این روش حد تشخیص 3/4 نانوگرم در میلی لیتر و محدوده کاری. عمومی 5/0 تا 1000 میکروگرم بر میلی لیتر بود،.بنابراین غلظت پروتئین را که می توان با روش سنتی BCA اندازه گیری کرد پایین آورد.
پروتکل:
1. 10μl استانداردهای BSA (ذخیره شده در فریزر 80- درجه سانتی گراد) را به هر یک از چاه های مناسب اضافه کنید.
2. 10 میکرولیتر نمونه ناشناخته به هر یک از چاه های مناسب اضافه کنید.
3. 20 میلی لیتر واکنش سنجش پروتئین BCA A را با 400μl BCA ترکیب کنید
واکنش سنجش پروتئین B در یک لوله مخروطی 50 میلی لیتری.
4. 200μl مخلوط معرف پروتئین BCA را به هر چاه اضافه کنید.
5. 30 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
6. با استفاده از Spectramax Plus 384 UV-Visible Plate Reader در CGR جذب را در 562 نانومتر بخوانید.
لینک ها مفید:
اولین دیدگاه را ثبت کنید