سنجش MTS و روش انجام آزمایش

armanbt

۲۵ مهر, ۱۴۰۰

بدون دیدگاه

3 دقیقه زمان مطالعه

نوع سنجش: کمی
روش تشخیص: رنگ سنجی
بستر: خواننده میکروپلیت
زمان سنجش: 4 ساعت
نوع نمونه: سلولهای چسبنده ، سلولهای تعلیق

سنجش MTS و روش انجام آزمایش

سنجش MTS روش جدیدی برای سنجش MTT است زیرا از نوع جدیدی از رنگ تترازولیوم استفاده می کند ، که در نهایت منجر به یک محصول محلول در فرماز در آب می شود. در اینجا ، رنگ تترازولیوم مورد استفاده در روش MTS 3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofhenyl) -2H-tetrazolium است. تشکیل رنگ محلول فرازان در حضور فنازین متوسولفات (PMS) رخ می دهد که به عنوان یک گیرنده واسطه الکترون عمل می کند و الکترون ها را از NADH منتقل می کند تا رنگ تترازولیوم را کاهش دهد و محصول محلول فرازان را تشکیل می دهد.

تشکیل مستقیم یک محصول محلول فرمازان مرحله انحلال محصول فرمازان روش MTT را کاهش می دهد. بنابراین ، روش MTS کارآمدتر و با زمان کمتر است. همچنین ، خطاهای احتمالی مانند از دست دادن سلول را که ممکن است در هنگام حذف محیط و حل شدن محصول فرازازان رخ دهد، حذف می کند. علاوه بر این ، محصول فرمازان تیره تر است. این امر حساسیت و دقت سنجش را افزایش می دهد.

سنجش MTS و روش انجام آزمایش

محلول MTS/PMS کافی را برای آزمایش، از جمله کنترل، با مخلوط کردن محلول PMS با محلول MTS طبق دستورالعمل سازنده تهیه کنید (Promega، G5421). به طور خلاصه شامل مخلوط کردن 1 میلی لیتر محلول PMS در هر 20 میلی لیتر محلول MTS است. مخلوط به دست آمده را می توان به صورت جداگانه تهیه کرد و قبل از استفاده در دمای 20- درجه سانتی گراد ذخیره کرد.

محلول MTS/PMS را 1: 5 در رقیق کننده مناسب (به عنوان مثال PBS ، یا محیط کشت بدون فنل قرمز) رقیق کنید.

– افزودن معرف MTS به محیط کشت سلولی

– به مدت 0.5 تا 4 ساعت در شرایط کشت استاندارد انکوبه کنید

– صفحه را به طور مختصر تکان دهید و میزان جذب را در 490 نانومتر اندازه گیری کنید.

سنجش MTS برای پلیت های استاندارد کشت سلولی یا صفحات چاه 96 چاه و سایر چاه های میکروتیتر مناسب است.

سنجش MTS اغلب برای اندازه گیری تکثیر سلولی در پاسخ به عوامل رشد ، سایتوکاین ها ، میتوژن ها و مواد مغذی و غیره استفاده می شود. آنها همچنین برای تجزیه و تحلیل ترکیبات سمیت سلولی مانند داروهای ضد سرطان و سایر عوامل سمی استفاده می شوند.

آماده سازی معرف

در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شود.
روش سنجش و تشخیص
همه مواد و معرفهای آماده شده را قبل از استفاده در دمای اتاق تعادل دهید.
توصیه می شود که کلیه کنترل ها و نمونه ها را به صورت تکراری مورد سنجش قرار دهید.

سلولهای کشت (5-100 10 103/چاه) در یک صفحه میکروتیتر 96 چاه در حجم نهایی 200 میکرولیتر/چاه. سلولها را می توان در غیاب یا وجود عوامل اضافی برای آزمایش زنده ماندن/تکثیر کشت داد.
اگر سلولها در حجمهای مختلف محیط کشت کشت می شوند ، مقدار معرف MTS را متناسب با آن تنظیم کنید.
سلولها را به مدت 20 تا 48 ساعت انکوبه کنید. زمان اینکوباسیون مناسب بستگی به نوع سلول و غلظت سلول مورد استفاده دارد. بنابراین ، توصیه می شود زمان اینکوباسیون مطلوب را برای یک آزمایش خاص تعیین کنید.
20 میکرولیتر/چاه MTS Reagent را به هر چاه اضافه کرده و به مدت 0.5 تا 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در شرایط کشت استاندارد انکوبه کنید.
پلیت را به طور مختصر روی یک شیکر تکان دهید و میزان جذب سلول های تیمار شده و تیمار نشده را با استفاده از دستگاه در OD = 490 نانومتر اندازه گیری کنید.

توجه: برای اندازه گیری میزان جذب بعداً ، 10 میکرولیتر SDS 10٪ به هر چاه اضافه کنید تا واکنش متوقف شود. صفحات تیمار شده با SDS محافظت شده از نور را در یک محفظه مرطوب در دمای اتاق تا 18 ساعت نگهداری کنید.

لینک های مفید: