10 نکته برای سنجش موفقیت آمیز مبتنی بر سلول
سنجش مبتنی بر سلول
سنجش های مبتنی بر سلول به عنوان یک افزودنی موثر و قوی برای تجلیل از فناوری های دیگر که برای کشف دارو و غربالگری با توان بالا مناسب هستند، پدیدار شده است. این سنحش ها جایگزینی مرتبط از نظر بیولوژیکی برای پیش بینی واکنش یک دارو بر روی ارگانیسم ارائه می دهد و در حالی که در ابتدا بیشتر برای غربالگری ثانویه استفاده می شد، اکنون به تدریج برای سنجش های اولیه استفاده می شود. این امر در غربالگری انواع ترکیبات بسیار ارزشمند بوده است. علاوه بر این، آنها در بسیاری از حوزه های تحقیقاتی مورد استفاده قرار می گیرند و اطلاعاتی در مورد اهداف و مسیرهای بیولوژیکی در کل سلول ارائه می دهند.
انتخاب روش غربالگری مبتنی بر سلول نیاز به درک، دستکاری و ملاحظات خاصی دارد. این باعث حذف منابع احتمالی خطاها و تنوع می شود که می تواند عملکرد سنجش را بدتر کند. موارد زیر 10 نکته است که برخی از عوامل مهمی را که هنگام انتخاب روش مبتنی بر سلول باید مورد توجه قرار گیرد، برای اطمینان از اجرای موفقیت آمیز روش مبتنی بر سلول، شرح می دهد:
-
انتخاب انواع سلول ها
انتخاب نوع سلول مناسب برای مطالعه یک عامل کلیدی برای به دست آوردن نتایج مربوطه و دستیابی به یک نتیجه تحقیق موفق است. انواع مختلف سلولها (سلولهای اولیه در مقابل لاین سلولی) شناخته شده اند که نشانگرهای زیستی متفاوتی تولید می کنند، که می تواند بر نتایج سنجش تأثیر بگذارد. سلولهای اولیه (HUVECs ، سلولهای کبدی و غیره) هنگام انجام مطالعات آزمایشگاهی گزینه های کاملی هستند، اما رشد و انتقال آنها مشکل است. هنگام انجام سنجش های زنده ماندن سلولی که از متابولیت استفاده می کنند، مهم است بدانید که رده های سلولی به طور کلی سرعت متابولیک بالاتری نسبت به سلول های اولیه دارند. به طور همزمان، میزان مرگ و میر سلولهای اولیه بیشتر است، که می تواند زمینه را هنگام اجرای سمیت سلولی ایجاد کند. بنابراین نوع سلول انتخابی شرایط سنجش را تعیین می کند.
-
درک آپوپتوز سلول
درک فرآیند و مکانیسم مرگ سلولی هنگام مطالعه یک نوع سلول خاص و تصمیم گیری در مورد سنجش مناسب بسیار مهم است. در طول آپوپتوز سلولها متابولیسم را متوقف می کنند، یکپارچگی غشا را از دست می دهند، مواد سیتوپلاسمی را در محیط اطراف آزاد می کنند و در نهایت می میرند. نشانگرهای زیستی خاصی از آپوپتوز مانند فعالیت کاسپاز به طور گذرا بیان می شوند، نیمه عمر بسیار کوتاهی دارند و بنابراین تنها در محدوده زمانی محدود قابل تشخیص هستند. در نهایت درک روند مرگ سلولی در نوع سلول خاص می تواند به تعریف طرح آزمایشی و انتخاب نقطه پایانی کمک کند.
-
اثر لبه یا Edge Effect
اثرات لبه به عنوان عواملی شناخته می شوند که در بدتر شدن عملکرد سنجش نقش دارند. علل اثر لبه پیچیده هستند و می توانند میزان رد صفحات بالا را در مراحل غربالگری ایجاد کنند. سلولهای موجود در چاههای اطراف لبه پلیت به دلیل اختلاف دما، ممکن است متفاوت از چاههای داخلی واکنش نشان دهند، که هنگام قرار دادن پلیت در دستگاه انکوباسیون ایجاد می شود. انباشته شدن صفحات روی یکدیگر و تبخیر در زمان انکوباسیون طولانی نیز باعث ایجاد اثر لبه می شود. به منظور اجتناب از این اثر، توصیه می شود نمونه های آزمایشی را کپی یا سه برابر کنید، زمان بندی، ترتیب صفحات و موقعیت پلیت را در دستگاه در حین سنجش کنترل کنید و مطمئن شوید که دمای دستگاه به طور مساوی توزیع شده است. رویکرد دیگر برای کاهش چشمگیر اثر لبه، انکوباسیون صفحات تازه کاشته شده در دمای اتاق قبل از قرار دادن آنها در دستگاه است.
-
از آلودگی خودداری کنید
آلودگی های بیولوژیکی مانند کپک، باکتری ها و سایر سلول ها می توانند نتایج نامتجانس و غیر قابل تکرار ایجاد کنند. محیط آزمایشگاه را ارزیابی کرده و مطمئن شوید که صفحات را در حین انکوباسیون بپوشانید. حتی کوچکترین آلودگی می تواند هفته ها تحقیق را خراب کند. علاوه بر این، قبل از اجرای آزمایش، بطری ها، پیپت ها و سایر مواد مرتبط را با اتانول پاک کنید. حمل و نقل یکی دیگر از مشکلات ناشی از شستشوی نامناسب نوک پیپت های قدیمی است. شستن تیپ قدیمی با EtOH و DMSO یکی از راه های رایج آزمایشگاه ها برای کاهش هزینه است. با این حال، این می تواند منجر به انتقال DMSO به چاهک ها شود و سیگنال بسیار کمتری را ایجاد کند. بنابراین توصیه می شود از تیپ های جدید استفاده کنید.
-
تنظیم دما و CO2
کنترل دما و CO2 برای حفظ زنده ماندن سلول در سنجش های مبتنی بر سلول بسیار مهم است. سلولهای باقی مانده در دمای اتاق قبل از انکوباسیون می توانند منجر به افزایش پس زمینه و در نتیجه کاهش نسبت سیگنال به پس زمینه شوند. این را می توان با هم زدن سلول ها روی یخ و در عین حال افزودن آنها به دسته های کوچکی از صفحات سنجش تصحیح کرد. این امر مدت زمان قرار گرفتن سلول ها در دمای اتاق را به حداقل می رساند و نتایج کلی سنجش را بهبود می بخشد. بسیاری از رده های سلولی نمی توانند قرار گرفتن در معرض دمای اتاق را تحمل کنند، در حالی که سایر سلول ها برای انجام آزمایش به درمان طولانی مدت دمای اتاق نیاز دارند. در نهایت هر رده سلولی متفاوت است و بنابراین شرایط آزمایشی مطلوب باید با توجه به هر رده سلولی تعیین شود. CO2 همچنین یک عامل هنگام انجام سنجش های مبتنی بر سلول است. اگر غلظت CO2 در طول انکوباسیون بسیار زیاد باشد، فعالیت سلول ها می تواند تحت تأثیر منفی قرار گیرد. تغییرات کوچک در عوامل محیطی مانند دما و CO2 می تواند تأثیر بسیار زیادی بر نتیجه سنجش داشته باشد.
-
خطاهای پیپت کردن سنجش مبتنی بر سلول
خطاهای پیپتینگ اشتباهات بسیار رایجی هستند که می توانند به دلیل زنده ماندن ضعیف، مرگ سلولی و سمیت سلولی کاذب منجر به نتایج متغیری شوند. سلولها باید به آرامی و به طور مساوی از چاه به چاه یا هنگام تهیه مقادیر منجمد توزیع شوند. برای جلوگیری از نادرستی در داده های تجربی، کالیبراسیون پیپت باید انجام شود.
-
بهینه سازی تراکم سلولی
تراکم سلولی ثابت در نمونه ها امکان تعیین دقیق حساسیت، محدوده سنجش و از همه مهمتر داده های قابل اعتماد را فراهم می کند. چاه هایی با کشت سلولی پراکنده می توانند منجر به حساسیت تشخیص بیشتر شوند. برعکس، کشتهای با چگالی سلولی بالا می توانند منجر به سیگنالهای زمینه ای بیشتری شوند و ممکن است زمان بیشتری را در معرض ترکیب با آزمایش قرار دهند، در نتیجه منجر به نتایج نادرست می شود. برای بهینه سازی تراکم سلولی، یک منحنی استاندارد از تعداد سلول های مختلف باید برای سنجش میزان زنده ماندن و سمیت سلولی ایجاد شود. این یک ایده دقیق از تراکم سلولی مورد نیاز قبل از معرفی ترکیبات آزمایشی به روش ارائه می دهد.
-
کنترلهای سنجش
استفاده از کنترل یک مرحله بسیار مهم در طراحی آزمایش است. تعیین می کند که روش به درستی عمل می کند یا خیر. علاوه بر این، نمونه های کنترل نقاط مرجع را برای مقایسه داده ها، به منظور مطالعه هر گونه متغیر در نمونه ها، ارائه می دهند. باید چندین کنترل در نظر گرفته شود که شامل کنترل های مثبت، کنترل های منفی (سلول های درمان نشده) و بدون سلول است. در نهایت این کنترل ها یک نقطه مرجع برای تجزیه و تحلیل داده ها و اطمینان بیشتر در نشانگر زیستی مورد مطالعه است.
-
ابزارها و پارامترهای تشخیص
ابزار تشخیصی که استفاده می شود نیز ممکن است بر نتیجه سنجش تأثیر بگذارد. مجموعه فیلترها، افزایش ابزارها و انواع ریز صفحه ها همه متغیرهای مهمی هستند که هنگام اجرای یک روش موفقیت آمیز مبتنی بر سلول باید در نظر داشته باشید. اگر تغییری در سیگنال فلورسنت ایجاد نشود، در حالی که تعداد سلولهای تیمار شده در مقابل سلولهای درمان نشده افزایش می یابد، می تواند به دلیل تنظیم نادرست فیلتر باشد. توصیه می شود حداکثر Ex/Em فلوروفور داده شده را با فیلتر مناسب تأیید کنید. میله خطای بزرگ بین نمونه های تصفیه شده و تیمار نشده می تواند نتیجه تنظیم بسیار کم ابزار باشد. صفحات ته شفاف اجازه می دهد تا مورفولوژی سلول قبل از آزمایش تجزیه و تحلیل شود، با این حال این صفحات می توانند منجر به افزایش تداخل شوند. صفحات چاه با نمای سیاه باید برای سنجش فلورسنت برای کاهش پراکندگی، همپوشانی سیگنال و تداخل متقابل استفاده شود.
-
تجزیه و تحلیل داده ها
عملکرد سنجش را می توان به روش های مختلف تجزیه و تحلیل کرد. نسبت سیگنال به پس زمینه یا پنجره سیگنال (S / B = میانگین سیگنال/میانگین پس زمینه) و نسبت سیگنال به نویز (S / N = میانگین سیگنال-میانگین پس زمینه / انحراف استاندارد پس زمینه) اغلب به عنوان معیار استفاده می شوند. از عملکرد سنجش متأسفانه، این نسبت ها تنوع سنجش را در نظر نمی گیرند. محاسبه آمار Z یا نمره ، اندازه گیری کیفیت سنجش را در نظر می گیرد، در حالی که هم نسبت سیگنال به نویز و هم تنوع سنجش را در نظر می گیرد. مقدار Z بیشتر باعث تکرارپذیری و دقت بیشتر سنجش می شود. یک روش سنجش کامل دارای ارزش Z= 1 است. برای یک روش غربالگری با توان بالا ، مقدار Z= ‘0.5 به طور کلی قابل قبول تلقی می شود. آمار Z ’در اصل برای ارزیابی سنجش HTS بدست آمده است، اما اندازه گیری کلی، کیفیت سنجش است و می تواند برای هر سنجشی به کار رود.
اولین دیدگاه را ثبت کنید