استخراج DNA چیست؟

مقدمه

استخراج DNA یا DNA Extraction فرایندی است که طی آن DNA با کمک ترکیبی از روش‌های فیزیکی و شیمیایی از نمونه جداسازی می‌شود. برای مطالعه DNA، ابتدا باید آن را از سلول خارج کرد که به آن جداسازی DNA می گویند. در سلول های یوکاریوتی، مانند سلول های جانوری و گیاهی، DNA در قالب کروموزوم ها در اندامی به نام هسته سازمان یافته است ولی در سلول های پروکاریوتی مثل باکتری ها که هسته ندارند، DNA آن ها به صورت حلقه یا پلاسمیدهای دایره ای شکل، در سیتوپلاسم قرار گرفته است. در فرآیند استخراج DNA، ابتدا DNA را از سلول استخراج و سپس آن را از مایع سلولی و پروتئین ها جدا می کنند و در نهایت DNA خالص باقی می ماند.

.

تاریخچه استخراج DNA

اولین جداسازی DNA توسط یک پزشک سوئیسی به نام Friedrich Miescher در سال 1869 انجام شد. وی امیدوار بود با پیدا کردن ترکیب شیمیایی سلول ها بتواند مفاهیم بنیادی حیات را حل کند.

.

او سعی داشت سلول ها را از غدد لنفاوی جدا کند اما خالص سازی لنفوسیت ها به مقدار کافی برای آزمایش، سخت و غیر ممکن بود. در ادامه از لکوسیت های موجود در چرک روی باند های جراحی، به جای لنفوسیت ها استفاده کرد.

.

***ببینید: انواع کیت های استخراج DNA***

.

در ابتدا میشر روی انواع مختلف پروتئین هایی که لکوسیت ها را تشکیل می دهند، تمرکز کرد و نشان داد پروتئین ها اجزای اصلی سیتوپلاسم سلول هستند.

وی در طی آزمایشات خود متوجه شد که وقتی اسید اضافه می شود ماده ای از محلول رسوب می کند و با افزودن قلیا دوباره محلول می شود و این اولین بار بود که رسوب خام DNA را به دست آورد.

میشر برای جدا کردن DNA از پروتئین های موجود در عصاره های سلول، پروتکل جدیدی را برای جداسازی هسته سلول ها از سیتوپلاسم ابداع کرد و سپس DNA را جدا کرد اما با این حال، اولین پروتکلش نتوانست بازده کافی برای تجزیه و تحلیل های بیشتر ارائه دهد. او پروتکل دومی را ابداع کرد که باعث شد مقادیر بیشتری از “نوکلئین” خالص شده به دست آید. مدتی بعد واژه “نوکلئین” توسط Richard Altman که دانشجوی میشر بود به “اسید نوکلئیک” تغییر کرد.

پس از آن در سال 1958، Meselson و Stahl یک پروتکل کامل برای استخراج DNA تهیه کردند. پروتکل سانتریفیوژ با شیب چگالی اولین پروتکل توصیف شده برای جداسازی DNA از باکتری E.coli بود.

پروتکل استخراج DNA بوسیله آنزیم پروتئیناز K توسط Lahiri و Nurenberger در سال 1991 ابداع شد. سپس آن ها پروتکل را با استفاده از Nonidet P-40 و SDS بهبود بخشیدند. با این حال استفاده از آنزیم پروتئیناز K در استخراج DNA کمی قبل از این توسط Miller و همکارانش در سال 1988 گزارش شده بود.

روش فنل-کلروفرم ایزوآمیل الکل یا PCI که در سال های اخیر محبوبیت زیادی داشت توسط Joseph Sambrook و David W. Russell ابداع شد.

.

هدف از جداسازی استخراج DNA

هدف اصلی استخراج یا جداسازی DNA، تهیه یک DNA خالص است، چون نمی توان از سلول ها یا بافت های بدن به طور مستقیم در آزمایش DNA استفاده کرد.

برای انجام آزمایش های مختلف DNA در جهت تعیین توارث یا مقاصد تشخیصی، به یک DNA خالص نیاز داریم لذا با استفاده از مواد شیمیایی و محلول های مختلف، اندامک ها و بقایای سلول ها از DNA جدا شده و DNA خالص استخراج می شود.

بنابراین هدف از استخراج DNA، تهیه یک نمونه DNA خالص، قطعه قطعه نشده و با غلظت بالا، برای انجام تست PCR است.

.

نحوه بدست آوردن DNA

در این قسمت، درک نحوه به دست آوردن DNA از سلول مهم است پس در ابتدا نگاهی گذرا به آناتومی سلول خواهیم داشت.

سلول از سیتوپلاسم و غشای سلولی یا دیواره سلولی تشکیل شده است. سیتوپلاسم شامل اندامک های مختلفی از جمله میتوکندری، ریبوزوم، هسته، شبکه آندوپلاسمی و غیره است. سلول های جانوری دیواره سلولی ندارند، اما سلول های گیاهی و اغلب سلول های باکتریایی دارای دیواره سلولی هستند. بنابراین اگر می خواهیم DNA را جدا کنیم، باید دیواره سلول یا غشای سلول و همچنین غشای هسته را بشکنیم. همچنین ما باید بقایای اندامک های سلولی را از بین ببریم و در آخرین مرحله، باید DNA را رسوب دهیم و خالص سازی کنیم.

این، طرح کلی در تمام روش های استخرج DNA است و برای دستیابی به نمونه DNA با کیفیت بالا و خوب باید این مراحل را دنبال کنیم:

1. تخریب یا لیز دیواره سلولی/ غشای سلولی

2. تخریب یا لیز غشای هسته ای

3. حذف بقایای اندامک ها و اسکلت سلولی

.

***ببینید: کیت های استخراج DNA از بافت و کیت های استخراج DNA از خون***

.

1- تخریب یا لیز دیواره سلولی / غشای سلولی:

• روش شیمیایی
• روش آنزیمی
• روش مکانیکی

.

2- تخریب یا لیز غشای هسته ای:

• روش شیمیایی
• روش آنزیمی

.

3- حذف بقایای اندامک ها و اسکلت سلولی:

• سانتریفیوژ

.

غشای هسته و غشای سلول تقریباً از پروتئین و لیپید تشکیل شده اند. از این رو مواد شیمیایی یکسانی می توانند بر روی هر دو غشا تاثیر گذار باشند.

مواد شیمیایی مانند SDS ،CTAB ،Tris و سایر دترجنت ها می توانند دیواره سلول یا غشای سلول را حل کنند. هر ماده شیمیایی عملکرد متفاوتی دارد که در هر روش جداگانه به آن خواهیم پرداخت.

آنزیم هایی مانند پروتئیناز K، پپتیداز و پروتئاز با هضم پروتئین ها آن ها را تخریب می کنند. این آنزیم ها عملکرد بهتری از سایر مواد شیمیایی دارند زیرا پیوندهای بین اسیدهای آمینه را هدف قرار داده و پروتئین ها را هضم می کنند.

هنگامی که دیواره سلول یا غشای سلول لیز شد، هیچ چیزی در داخل سلول باقی نمی ماند و تمام اندامک ها و اجزای سلولی در محلول، مخلوط می شوند. با انجام سانتریفیوژ با سرعت بالا، DNA در محلول رویی باقی مانده و دیگر بقایای سلول در پایین لوله قرار می گیرند.

.

در نهایت روش های استخراج DNA، بسته به نوع سلول ها متفاوت است. به مثال های زیر توجه کنید:

.

سلول هایی که دیواره سلولی نازک یا نرمی دارند:

برخی از باکتری ها دیواره سلولی بسیار صاف و نرمی دارند. به عنوان مثال M.tuberculosis دارای دیواره سلولی نازک است و فقط با گرم کردن محلول باکتریایی می توانیم دیواره سلول را لیز کنیم. از مایع رویی می توان مستقیماً برای PCR استفاده کرد. حتی با قرار دادن کشت باکتریایی به طور مستقیم در میکروتیوب PCR به مدت 15 دقیقه در مرحله دناتوره شدن اولیه، می توانیم کیفیت خوبی از نتیجه PCR بدست آوریم.

با این حال افزودن یک بافر لیز ساده در هنگام گرمایش، باعث افزایش  بازده محصول DNA و کیفیت آن می شود.

.

***ببینید: کیت های استخراج DNA از باکتری***

.

سلولی های که دیواره سلولی سخت تری دارند:

سلول های گیاهی دارای پکتین و سایر پلی ساکاریدها در دیواره سلولی خود هستند. پکتین از سلول در برابر آسیب مکانیکی محافظت می کند بنابراین قدرت بیشتری به دیواره سلول گیاهی می دهد.

برخی از قارچ ها، جلبک ها و باکتری ها نیز دارای دیواره سلولی سخت، برای زنده ماندن در شرایط دشوار هستند. برای استخراج DNA از این نوع سلول ها، باید پروتکل را با ترکیبی از روش های مکانیکی-شیمیایی-آنزیمی اصلاح کنیم.

لیز مکانیکی گام مهمی در جداسازی DNA از سلول های غنی از پکتین است. برای انجام لیز مکانیکی ابتدا بافت گیاهی را در هاون ریخته و با دسته هاون آن را خوب می کوبیم و می ساییم. سپس با دقت فراوان ازت یا نیتروژن مایع را اضافه کرده و باز به ساییدن ادامه می دهیم تا در نهایت نمونه گیاهی به پودر تبدیل شود و سپس بقیه مراحل استخراج را انجام می دهیم.

.

***ببینید: کیت های استخراج DNA از گیاه***

.

سلول هایی که دارای غشای سلولی هستند:

دیواره سلول در سلول های جانوری وجود ندارد. ترکیبی از روش آنزیمی و شیمیایی برای استخراج DNA از سلول های جانوری مناسب ترین روش است. روش فنل-کلروفرم یکی از بهترین انتخاب ها برای سلول های جانوری است.

.

.

انواع روش های استخراج DNA

 

عکس DNA استخراج شده

.

روش های استخراج DNA به طور کلی به دو دسته تقسیم می شوند:

1. روش استخراج DNA با استفاده از مواد شیمیایی و محلول ها
2. روش استخراج DNA بر اساس فاز جامد

.

***ببینید: کیت های استخراج DNA از ژل و محصول PCR***

.

.

1. روش استخراج DNA با استفاده از شیمیایی و محلول ها

در این روش از انواع مختلف محلول های آلی و غیرآلی استفاده می شود اما مراحل استخراج DNA در تمام روش ها یکسان است.

SDS ،CTAB، فنل، کلروفرم، ایزو آمیل الکل، تریتون X100، گوانیدیم تیوسیانات، Tris و EDTA چندین ماده شیمیایی رایجی هستند که در روش استخراج DNA با استفاده از مواد شیمیایی و محلول ها، استفاده می شوند.

این روش به دو دسته کلی تقسیم می شود:

الف. استخراج DNA مبتنی بر حلال آلی

ب. استخراج DNA مبتنی بر حلال غیر آلی

.

الف- استخراج DNA مبتنی بر حلال آلی:

این روش براساس استفاده از مواد آلی مانند فنل و کلروفرم است ولی با توجه به مضر بودن این دو ماده، استفاده از این روش محدود شده است. با این وجود روش استخراج DNA با فنل-کلروفرم-ایزآمیل الکل یا PCI یکی از بهترین روش ها در بین همه است.

.

روش فنل-کلروفرم استخراج DNA

این متد یکی از بهترین روش های استخراج DNA است. عملکرد و کیفیت DNA به دست آمده با روش PCI بسیار خوب است اگر آن را به درستی انجام دهیم. این روش همچنین فنل-کلروفرم و ایزوآمیل الکل یا  PCI نامیده می شود.

مهم ترین مواد شیمیایی این روش عبارتند از:

1. بافر لیز
2. فنل
3. کلروفرم

بافر لیز حاویTris ،EDTA ،MgCl2 ،NaCl ،SDS و سایر نمک ها است. در اینجا اجزای بافر لیز به تخریب غشای سلول و همچنین تخریب غشای هسته ای کمک می کنند. بخش پروتئینی سلول با کمک کلروفرم و فنل که از دسته ترکیبات آلی هستند، دناتوره می شود.

.

نقش مواد شیمیایی:

.

Tris:

مولکول DNA به pH حساس است، بافر Tris باعث حفظ pH محلول می شود. همچنین، با لیپوپلی ساکاریدهای غشای سلولی تداخل می کند و آن ها را نفوذ پذیر می کند، این امر به لیز غشای سلول کمک می کند.

.

EDTA:

یک عامل شلاته کننده است و برای جلوگیری از فعالیت DNase مورد استفاده قرار می گیرد. DNase آنزیمی است که DNA را تخریب می کند. هر آنزیمی برای عملکرد صحیح به کوفاکتور نیاز دارد. EDTA با مسدود کردن محل اتصال کوفاکتور، فعالیت DNase را مسدود می کند و در ترکیب با Tris بهترین عملکرد را خواهد داشت.

.

SDS:

سدیم دودسیل سولفات یک شوینده آنیونی است که به لیز شدن غشای سلول و پوشش هسته ای کمک می کند.

.

NaCl:

یون Na⁺ با بار منفی DNA پیوند یونی ایجاد کرده و آن را خنثی می کند و از دناتوراسیون محافظت کند.

.

MgCl₂:

به طور کلی از DNA محافظت می کند. MgCl₂ بار منفی لیپوپروتئین های غشای سلول را بلاک می کند. پس از لیز سلول از مخلوط شدن DNA با دیگر اندامک های سلول جلوگیری می کند.

.

فنل:

باعث رسوب ناخالصی های پروتئینی می شود. ترکیبی از فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل به حذف پروتئین کمک می کند. پس از سانتریفیوژ، فنل در پایین لوله جمع می شود و DNA در فاز آبی قرار دارد در حالی که پروتئین دناتوره به صورت یک لایه نازک ابر سفید رنگ بین هر دو لایه باقی می ماند.

باید در جمع آوری اسید نوکلئیک که در فاز آبی بالای پروتئین قرار دارد بسیار دقت کرد زیرا ممکن است لایه نازک پروتئین هم جمع آوری شود. اسید نوکلئیک جمع آوری شده با کمک الکل از قبل سرد شده (الکل ایزوآمیل) رسوب می کند. همچنین می توانیم با اضافه کردن نمک بازده استخراج DNA را افزایش دهیم. در نهایت DNA در بافر TE حل می شود.

به دلیل استفاده از حلال های آلی، از این روش به عنوان روش استخراج DNA مبتنی بر حلال های آلی یا ارگانیک نیز، نام برده می شود.

روش استخراج DNA با PCI به طور گسترده ای پذیرفته شده است. مقدار DNA به دست آمده با روش بسیار زیاد است و می توان 800 تا 900 نانوگرم DNA با کیفیت عالی بدست آورد.

اگر همه مواد شیمیایی به خوبی آماده شوند و دستورالعمل با دقت و درست انجام شود، همیشه می توان با این روش نتیجه خوبی گرفت.

.

.

ب- استخراج DNA مبتنی بر حلال غیر آلی:

در این میان دو مورد بیشترین محبوبیت را دارند: استفاده از آنزیم پروتئیناز K و استفاده از نمک.

روش استخراج DNA با آنزیم پروتئینازK، بازده تولید DNA را زیاد می کند اما این روش وقت گیر است. همچنین اگر آنزیم به خوبی در یک زنجیره سرد نگهداری نشود، نمی توان از آن برای مدت زمان طولانی استفاده کرد. پایداری پایین آنزیم مسئله اصلی دیگر در این روش است.

استخراج DNA به روش Salting out، ایمن تر از روش فنل-کلروفرم-ایزوآمیل الکل یا PCI است. استفاده از نمک هایی مانند کلرید سدیم، استات پتاسیم و استات آمونیوم به استخراج DNA کمک می کند و می تواند بازده را افزایش دهد اما خلوص DNA حاصل از آن به اندازه کافی خوب نیست.

.

روش آنزیمی استخراج DNA

در واقع این روش ترکیبی از یک روش نمکی و یک روش آنزیمی است. در این جا قبل از مرحله هضم آنزیمی، از بافر استخراج استفاده می شود.

ترکیب بافر استخراج ممکن است از آزمایشگاهی به آزمایشگاه دیگر متفاوت باشد، با این حال اجزای اصلی شامل Tris،EDTA ، NaCl ، لوریل سدیم و SDS هستند. در این جا از فنل، کلروفرم یا ایزوآمیل الکل استفاده نمی شود. در عوض از آنزیم پروتئیناز K برای هضم نمونه استفاده می شود.

نمونه به مدت 2 ساعت با آنزیم پروتئیناز K انکوبه می شود و این باعث هضم تمام پروتئین های موجود در داخل نمونه می شود.

بلافاصله پس از هضم با پروتئیناز K، نمونه توسط الکل سرد رسوب می کند. با سانتریفیوژ نمونه، سایر بقایای سلول از بین می رود. سرانجام پلت DNA در بافر TE حل می شود.

این روش استخراج DNA سریع و آسان است و می توان از بافر آماده استخراج DNA استفاده کرد ولی کیفیت DNA یکی از نگرانی های اصلی این روش است.

.

.

.

2. روش استخراج DNA براساس فاز جامد

سیلیس یا سیلیکا ماده جامدی است که در حین مراحل استخراج، DNA به آن متصل می شود و سپس از محلول های مختلف برای خالص سازی DNA استفاده می شود. مزیت اصلی استخراج DNA مبتنی بر ژل سیلیکا این است که سریع است و «DNA آماده PCR» را برای سایر تست ها فراهم می کند. به هیچ مرحله استخراج یا رسوبدهی نیازی نیست بنابراین این روش برتر از سایر روش ها است.

.

روش استخراج DNA مبتنی بر ستون سیلیکا

این روش بسیار منحصر به فرد و متفاوت از سایر روش های استخراج DNA است. در روش PCI یا پروتئیناز K ما باید نمونه را بارها سانتریفیوژ کنیم و بسته به مرحله استخراج، باید فازهای آبی یا پلت ها را جمع آوری کنیم.

این روش براساس اثر متقابل بین سیلیس و DNA کار می کند به این صورت که ذرات سیلیس با بار مثبت به مولکول DNA با بار منفی متصل می شود و آن را در حین سانتریفیوژ نگه می دارند.

این روش اولین بار توسط McCormick در سال 1989 توصیف شد. اما ایده اصلی مربوط به سال 1979 است، زمانی که سیلیس در استخراج DNA توسط  Vogelsteinاستفاده شد.

روش استخراج DNA فاز جامد مبتنی بر سیلیس، اکنون به صورت کیت تجاری در دسترس است و به طور معمول در آزمایشگاه های تشخیصی مورد استفاده قرار می گیرد و به دلیل بازده DNA با کیفیت خوب و سیستم کاربری حداقلی و ساده، به طور گسترده ای پذیرفته شده است.

.

استخراج DNA با استفاده از رزین های آنیونی

Chelex محصول آزمایشگاه های Bio-Rad بهترین نمونه از رزین آنیونی مورد استفاده در استخراج DNA است. Chelex با بار مثبت به فسفات DNA با بار منفی متصل می شود و به استخراج DNA کمک می کند. با این حال گاهی اوقات آلودگی های دارای بار منفی نیز در پروسه استخراج DNA تداخل ایجاد می کنند.

chelex از کوپلیمرهای استایرن-دیوینیل بنزن تشکیل شده است. استفاده از chelex به عنوان رزین آنیونی برای استخراج DNA برای اولین بار توسط Walsh و همکارانش در سال 1991 توصیف شد.

رزین دیگری که Seligson و همکارانش از آن استفاده کردند، دی اتیل آمینو اتیل بود.

در این روش ستون لوله با رزین های مثبت پر می شود. لایزیت سلولی از ستون عبور می کند و DNA به رزین های دارای بار مثبت متصل می شود.

با استفاده از بافر نمکی با غلظت کم، پروتئین ها و سایر ناخالصی ها شسته شده و فقط DNA در ستون باقی می ماند.

در مرحله آخر توسط بافر نمکی با غلظت بالا، DNA از رزین شسته شده و با استفاده از الکل رسوب می کند.

از این روش به عنوان استخراج DNA از طریق کروماتوگرافی تبادل آنیونی نیز یاد می شود.

.

استخراج DNA توسط مهره ها یا بیدهای مغناطیسی

مهره های مغناطیسی با بار مثبت، DNA با بار منفی را جذب می کنند. DNA تحت میدان مغناطیسی جدا می شود. بافر استخراج DNA در این روش نیز مورد نیاز است.

.

استخراج DNA با گرادیان یا شیب چگالی سزیم کلراید

سانتریفوژ CsCl (کلرید سزیم) روشی برای جداسازی DNA بر اساس چگالی است. برای جداسازی DNA بر اساس چگالی، DNA با CsCl مخلوط شده و با سرعت بسیار بالا (به عنوان مثال50،000 دور در دقیقه) در یک دستگاه سانتریفیوژ به مدت چند ساعت سانتریفیوژ می شود. همانطور که لوله ها می چرخند، نیروهای متضاد رسوب و انتشار یک شیب خطی پایدار از CsCl، با کمترین چگالی در بالا و سنگین ترین چگالی در پایین تولید می کنند.

با تشکیل گرادیانCsCl ، DNA در جایی که چگالی آن برابر با چگالی CsCl اطراف است به تعادل می رسد. اگر DNA موجود در نمونه فقط یک چگالی داشته باشد، نتیجه آن یک باند واحد DNA خواهد بود. اگر در نمونه دو DNA با چگالی های متفاوت وجود داشته باشند، نتیجه آن دو باند DNA خواهد بود.

این روش سخت و طاقت فرسا است زیرا برای بیش از 10 ساعت به سانتریفیوژ با سرعت بالا نیاز داشت.

.

.

نتیجه‌گیری

به طور قطع انتخاب یکی از انواع روش های استخراج DNA، به نیاز ما بستگی دارد. با این حال بهترین روش در آزمایشگاه تحقیقاتی روش PCI است و برای تشخیص، کیت استخراج DNA با روش ستونی انتخاب بی نظیری است.

اما یک نکته را به خاطر داشت که در حین کار با کیت تجاری آماده، بافرها، ستون های استخراج و سایر موارد مورد نیاز توسط سازنده کیت تهیه شده اند و در بسته بندی کیت قرار دارند و فقط باید مراحل کار مطابق پروتکل داده شده دنبال شود و نباید در آن دخل و تصرفی ایجاد کرد. اگر به دنبال خرید کیت های استخراج DNA هستید، می توانید از طریق آرمان بایوتک اقدام نمایید.