سنجشMTT و روش انجام آزمایش

armanbt

۲۵ مهر, ۱۴۰۰

بدون دیدگاه

3 دقیقه زمان مطالعه

نوع سنجش: کمی

روش تشخیص: رنگ سنجی
بستر: خواننده میکروپلیت
زمان سنجش: 3 ساعت 15 دقیقه
نوع نمونه: سلولهای چسبنده ، سلولهای تعلیق

سنجشMTT و روش انجام آزمایش

سنجش MTT یک روش رنگ سنجی برای ارزیابی فعالیت متابولیک سلول است. آنزیمهای اکسیدوروکتاز سلولی وابسته به NAD (P) ممکن است تحت شرایط تعریف شده، تعداد سلولهای زنده موجود را منعکس کند. این آنزیم ها قادرند رنگ تترازولیوم MTT 3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -2،5-diphenyltetrazolium bromide را به فرمازان نامحلول که دارای رنگ بنفش است، کاهش دهند. سایر رنگهای تترازولیوم از جملهXTT ،MTS و WSTs در ارتباط با گیرنده الکترون واسطه، 1-متوکسی فنازین متوسولفات (PMS) استفاده می شود. با WST-1، که سلول غیرقابل نفوذ است، کاهش در خارج از سلول از طریق انتقال الکترون غشای پلاسمایی اتفاق می افتد.

از روش های رنگ آمیزی تترازولیوم نیز می توان برای سمیت سمیت سلولی (از دست دادن سلول های زنده) یا فعالیت سیتو استاتیک (تغییر از تکثیر به سکون) از داروهای بالقوه و مواد سمی استفاده کرد. سنجش MTT معمولاً در تاریکی انجام می شود، زیرا معرف MTT به نور حساس است.

فهرست

سنجشMTT و روش انجام آزمایش

کاهش رنگ تترازولیوم عموماً به آنزیم های اکسیدوروکتاز وابسته به NAD (P) H وابسته است که عمدتا در قسمت سیتوزولی سلول هستند. بنابراین ، کاهش MTT و سایر رنگهای تترازولیوم بستگی به فعالیت متابولیک سلولی ناشی از شار NAD (P) H دارد. سلولهای با متابولیسم پایین مانند تیموسیتها و اسپلنوسیتها MTT بسیار کمی را کاهش می دهند. در مقابل، تقسیم سریع سلول ها میزان بالایی از کاهش MTT را نشان می دهد. مهم است که به خاطر داشته باشید که شرایط سنجش می تواند فعالیت متابولیک و در نتیجه کاهش رنگ تترازولیوم را بدون تأثیر بر زنده ماندن سلول تغییر دهد.

علاوه بر این، مکانیسم کاهش رنگهای تترازولیوم ، یعنی داخل سلولی (MTT ، MTS) در مقابل خارج سلولی (WST-1) ، مقدار محصول را نیز تعیین می کند. علاوه بر این، شواهدی مبنی بر کاهش خود به خود MTT در محفظه/ساختارهای سلولی چربی، بدون دخالت آنزیمی ارائه شده است. با این وجود ، حتی تحت این پارادایم جایگزین، سنجش MTT هنوز هم پتانسیل کاهش یک سلول (یعنی در دسترس بودن ترکیبات کاهش دهنده برای هدایت انرژی سلولی) را ارزیابی می کند. به این ترتیب، تفسیر نهایی زنده ماندن سلول بدون تغییر باقی می ماند.

در مطالعه قابلیت زنده ماندن سلولهای کاشته شده روی داربستهای فیبری سه بعدی، ضخامت داربستها ممکن است بر نتایج سنجش MTT تأثیر بگذارد.

آماده سازی معرف سنجشMTT و روش انجام آزمایش

محلول MTT را آماده کنید.

MTT در آب (10 میلی گرم در میلی لیتر) ، اتانول (20 میلی گرم در میلی لیتر) و محلول های نمک بافر شده و محیط کشت (5 میلی گرم در میلی لیتر) محلول است. توصیه می کنیم از محلول 5 میلی گرم در میلی لیتر در PBS استفاده کنید. با ورتکس کردن مخلوط کنید.

پس از افزودن MTT محلول را استریل نمایید.
محلول MTT را در دمای 20- درجه سانتی گراد (حداقل 6 ماه پایدار) نگهداری کنید. بیش از چند روز در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری نشود.

حلال MTT را آماده کنید

4 میلی مولار HCl ، 0.1٪ NP40 در ایزوپروپانول

پروتکل انجام سنجش MTT

محیط های کشت سلولی را دور بریزید. برای سلولهای چسبنده، محیط را با دقت آسپیراسیون کنید. برای سلولهای تعلیق، صفحه 96 چاه را در 1000 xg و دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه در سانتریفیوژ سازگار با میکروپلیت بچرخانید و محیط را با دقت آسپیراسیون کنید.
یک روش جایگزین اضافه کردن حجم مساوی از محلول MTT به محیط کشت های موجود در چاهک است. اطمینان حاصل کنید که حجم یکسانی از محیط های موجود برای هر نمونه وجود دارد.
50 میکرولیتر محیط بدون سرم و 50 میکرولیتر محلول MTT را در هر چاه اضافه کنید.
پلیت را به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
پس از انکوباسیون، 150 میکرولیتر حلال MTT را به هر چاهک اضافه کنید.
بشقاب را در فویل بپیچید و به مدت 15 دقیقه روی شیکر مداری تکان دهید. گاهی اوقات ممکن است برای حل کامل فورمازان MTT به پیپتینگ مایع نیاز باشد.
جذب را در OD = 590 نانومتر بخوانید. ظرف را در عرض 1 ساعت بخوانید.

یادداشت

سرم یا فنل قرمز موجود در محیط کشت می تواند زمینه ایجاد کند. اگر نمونه شما حاوی سرم یا فنل قرمز است، نمونه های زمینه کنترل را تنظیم کنید: 50 µL معرفMTT+ محیط کشت سلولی 50 µL(بدون سلول).

چاهک (های) موازی را به عنوان کنترل حلال آماده کرده و از همان حجم حلال برای سلولهای تیمار شده استفاده کنید.

تحلیل داده ها سنجشMTT و روش انجام آزمایش

روشهای تکثیر سلولی

از خوانش های تکراری برای هر نمونه میانگین بگیرید.
جذب زمینه محیط را از نمونه خود کم کنید.
میزان جذب متناسب با تعداد سلول است.
برای شمارش سلولها، یک منحنی استاندارد با تعداد سلولهای شناخته شده و زمانهای نهفتگی ثابت با معرف سنجش ایجاد می شود.

سنجش سمیت سلولی