محیط کشت AmnioZ مخصوص سلول های مایع آمنیون، محصول کیازیست

محیط کشت AmnioZ کیازیست

محیط کشت AmnioZ به منظور ارتقا رشد سلول های مایع امنیون  طراحی شده است. این محیط حاوی محیط کشت پایه Alpha-MEM اصلاح شده، هورمون ها و فاکتورهای رشد می باشند. محیط حاصل به صورت کامل بوده و نیازی به افزودنی ندارد و آماده بکار می باشد.

سلول های کشت داده شده در این محیط به منظور سایتوژنتیک و سایر تکنیک های مرتبط تشخیص بیماری جنینی کاربرد گسترده دارد. پایداری pH، رشد سریع سلول ها و محیط کشت بدون دبرید از جمله ویژگی های این محصول می باشد.

طراحی این محیط به دو صورت Open و Close می باشد.

• در سیستم Close نیازی به گاز CO₂ به منظور حفظ pH محیط نیست و برای نمونه هایی با مقدار مایع آمنیوتیک کم مناسب می باشد و رشد سلول تسریع می شود. در این سیستم به هیچ عنوان از گاز CO₂ استفاده نمی شود زیرا منجر به مرگ سلول می شود.
• در سیستم Open به منظور حفظ pH محیط از گاز CO₂ استفاده می شود که برای نمونه های با مقدار کافی مناسب می باشد.

دمای نگهداری

آماده سازی مایع امنیوتیک برای کشت محیط کشت AmnioZ کیازیست

1.نمونه های مایع امنیوتیک داخل سرنگ یا تیوب مناسب کشت سلول را تا زمان کشت در دمای اتاق نگهداری کنید. نمونه نباید بیشتر از یک روز در سرنگ باقی بماند.

2 . سرنگ یا تیوب را به طور ملایم سر و ته کنید تا سلول ها به طور یکنواخت پخش شوند.
3 . نهایتا نمونه را به تیوب منتقل کرده و به مدت 10 دقیقه در 200 × g سانتریفیوژ کنید. نمونه مورد نیاز برای لوله لیتون حداقل 3 میلی لیتر و برای فلاسک T2 و دیش حداقل 5 میلی لیتر مورد نیاز می باشد. سپس ظرف مورد نظر خود را نامگذاری کنید.
4 . بدون اینکه پلت سلولی را دچار تکان کنید در زیر هود لامینار سوپرناتانت را طوری برداشت کنید به طوری که یک میلی لیتر از مایع امنیوتیک بالای آن باقی بماند.

5 . از مایع امنیوتیک برداشته شده می توانید برای سایر تست های بیوشیمیایی مرتبط نیز استفاده کنید.
6 . در ادامه یک میلی لیت ر از محیط کشت از پیش گرم شده را روی آن بریزید.
7 . سپس به آرامی کنار تیوب را ضربه بزنید تا پلت سلولی جدا شده و در محیط کشت حل شود. اگر با Coverslip و فلاسک کار می کنید سعی کنید تمامی نمونه را در مرکز آن بریزید تا به صورت جزیره ای در مرکز آن باقی بماند.
8 . در ادامه دیش را تا 2 روز در انکوباتور با دمای 37 ˚C انکوبه کنید. ترجیحا فلاسک T25 با درب بدون فیلتر برای سیستم Close مناسب می باشد.

کشت ثانویه

بعد از زمان مورد نظر بدون خارج کردن محیط قبلی مجددا AmnioZ اضافه کنید. (Flood Stage)
2 . سپس مجددا به مدت 2 روز در انکوباتور و با توجه به سیستم مورد استفاده انکوبه کنید.

3 . در ادامه هر سه روز یکبار 50 % از محیط قبلی را خارج و با محیط جدید جایگزین کنید. (Feed Stage)
4 . با میکروسکوپ اینورت تشکیل کولونی را چک کنید.
5 . محیط هر سه روز باید تعویض شود تا کولونی سلول ها شکل بگیرد.

برداشت سلول در فاز متافاز محیط کشت AmnioZ کیازیست

مانیکه کولونی ها شکل گرفتند به آن 50 میکرولیت ر از Colcemid با غلظ ت 10 mg/mL به ازای 2 میلی لیتر محیط کشت اضافه نمایید. سپس دیش را به آرامی تکان دهید تا محلول یکنواخت شود.
2 . در انکوباتور به مدت 20 دقیقه انکوبه کنید .
3 . در ادامه به لبه داخلی دیش بدون برداشت محیط کشت، یک میلی لیتر بافر HBSS یا PBS هایپوتونیک اضافه نمایید.
4 . 12 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کرده و مایع رویی سلول ها را برداشت نمایید.

5 . مجددا 2 میلی لیتر از محلول هایپوتونیک به دیش اضافه کرده و 12 دقیقه دیگر در دمای اتاق انکوبه کنید.
6 . به آرامی یک میلی ل یتر از فیکس کننده متانول / اسید است یک خالص که تازه آماده شده با نسبت 6 به 1 اضافه کنی د. سپس اجازه ده ید ظرف به مدت 12د قیقه بماند. محلول را از لبه دیش آسپیره کرده و دور بریزید.

7 . مرحله 6 را با نسبت 3 به 1 از متانول/ استیک اسید دو یا سه بار تکرار کنید و هر بار 10 دقیقه انکوبه کنید و آخرین محلول فیکس را در پایان کار دور نریزید .
8 . با فورسپس coverslip را از دیش بیرون آورده و با تماس دادن کنار آن با کاغذ جاذب محلول اضافه را خارج نمایید.
9 . سپس Coverslip را به صورت مورب )سمت سلول بالا( به روی دیش بگذارید )یک سمت روی دیش یک سمت روی کاغذ( به مدت 3 دقیقه صبر کنید تا خشک شود.

10. سپس به دمای 60 ˚C منتقل کنید . به مدت 10 دقیقه انکوبه کنید .
11 . coverslip را نام گذاری کرده و به مدت 4 ساعت در 60 ˚C انکوبه نمایید. این زمان نباید از 24 ساعت بیشتر شود .
12 . می توانید از تریپسین برای رزولوشن بالا استفاده نمایید.
13 . در پایان رنگ آمیزی اسلایدها را طبق پروتکل های استاندارد انجام دهید .

لینک های مفید

• دریافت کتابچه محصول
• مشاهده محصولات بیشتر