نقد و بررسی
کیت اندازه گیری پروتئین به روش BCA، محصول کیازیستکیت اندازه گیری پروتئین به روش BCA
سنجش پروتئین به روش BCA روشی است که برای اندازه گیری مقدار پروتئین در یک نمونه استفاده می شود. اصول روش بدین صورت است که پروتیین می تواند در یک محیط قلیایی Cu+2را به Cu+1احیا کند (واکنش بیوره) و در حضور bicinchoninic acid منجر به تولید رنگ ارغوانی شود.
این روش در مقایسه با روش برادفورد روش دقیق تری است چرا که تمامی زنجیره های پیوندهای پپتیدی در تشکیل رنگ شرکت می نمایند. همچنین برخلاف روش برادفورد بادترجنت هایی مانند NP-40، Triton-X100 و یا SDS تداخل ندارد. کمپلکس CU+1-BCA در طول موج 560 nm دارای جذب است که این طول موج تداخل کمتری با عوامل دیگر ایجاد می کند.
انواع نمونه کیت اندازه گیری پروتئین به روش BCA
- سرم
- پلاسما
- لیزات بافتی
- لیزات سلولی
- بزاق
- ادرار
- مایعات بیولوژیک
- عصاره گیاهان
محتویات کیت
| مقدار/تعداد | ماده | شماره |
| 5 mL | BCA Reagent | 1 |
| 150 µL | Cu Solution | 2 |
| 150 µL | Albumin Standard (2 mg/mL) | 3 |
| 1 | 96-well Photometric Plate | 4 |
آماده سازی نمونه
هموژن کردن بافت
نمونه بافت: 10 تا 20 میلی گرم از بافت را توسط سونیکاتور و یا هموژنایزر در بافر PBS )یا بافر جایگزین( که حاوی کوکتل مهارکننده پروتئاز می باشد لیز کرده و سپس در 12000 rpm به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ کنید . سوپرناتانت را در تیوب جدید در دمای -80˚C فریز کنید .
سلول های چسبنده
محیط را خالی و سپس سلول ها را تریپسینه کرده و پس از سانتریفیوژ کردن سوپرناتانت را دور ریخته و در بافر PBS )یا بافر جایگزین( که حاوی کوکتل مهارکننده پروتئاز می باشد تا 3 بار فریز و دفریز نمایید تا سلول ها لیز شوند. سپس در 12000 rpm به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ کنید . سوپرناتانت را در تیوب جدید در دمای -80˚Cفریز کنید .
سلول های معلق
پس از سانتریفیوژ کردن سوپرناتانت را دور ریخته و در بافر PBS )یا بافر جایگزین( که حاوی کوکتل مهارکننده پروتئاز می باشد تا 3 بار فریز و دفریز کرده تا سلول ها لیز شوند. سپس در 12000 rpm به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ کنید.
سوپرناتانت را در تیوب جدید در دمای -80˚C فریز کنید .
نمونه پلاسما
خون را در تیوب حاوی ضد انعقاد ریخته و به مدت 10 دقیقه در 1000×g سانتریفیوژ کنید. پلاسمای زرد رنگ را بدون آسپیره کردن لایه سفید بافی (لکوسیت) برداشته و تا زمان آزمایش در دمای -80˚C فریز کنید.
روش انجام آزمایش
1.در هر چاهک 20 μl از نمونه ها و یا استانداردها را بصورت مجزا اضافه کنید.
* نمونه ها با پروتئین با غلظت بالا مانند سرم و یا لیزات های بافتی غنی از پروتئین می بایستی به اندازه ای رقیق شوند تا اینکه در محدوده جذب منحنی استاندارد قرار بگیرند و قابلیت سنجش در روش کنونی را داشته باشند.
** در صورتیکه نمونه شما حاوی پروتئین کم می باشد مقدار نمونه را تا 50 میکرولیتر افزایش دهید.
2.در چاهک دیگری 20 μl از بافر لیزات به عنوان بلانک اضافه کنید.
3 . سپس 50 μL محلول کاری را به هر یک از چاهک ها اضافه نموده و به خوبی مخلوط نمایید.
4 . پلیت را به مدت 25 دقیقه در دمای 55˚C انکوبه نمایید. در پایان پلیت را در دمای اتاق خنک نمایید.
5. عدد جذب را با استفاده از دستگاه Plate Reader در طول موج 520-570 nm قرائت نمایید. ابتدا از چاهک های دوتایی میانگین بگیرید. سپس با استفاده از یک نرم افزار مناسب مانند اکسل نمودار منحنی استاندارد را رسم کنید )غلظت های استاندارد در محور X و جذب خوانده شده استاندارد در محور Y قرار می گیرد(. توسط فرمول منحنی، مقادیر نمونه ها را بر اساس μg/mL بدست آورید.
3 . در ادامه از فرمول زیر اقدام کنید:
کیت اندازه گیری پروتئین به روش BCA
در صورتیکه منحنی شما به صورت خطی در نیامد، از نوع معادله درجه 2 بوده و می توانید از منحنی نوع Polynomial درجه دوم استفاده کنید. برای محاسبه خودکار از نرم افزار Curve expert نسخه Basic نیز می توانید محاسبه را انجام دهید.
لینک ها مفید:
0دیدگاه