نقد و بررسی
کیت سنجش پروتئین برادفورد در دو حجم، محصول سیب زیست فناساس روش برادفورد
روش برادفورد (Bradford) یکی از پرکاربردترین تکنیک هایی است که برای تعیین غلظت پروتئین در محلول توسعه یافته است. رنگ کوماسی بریلینت بلو (Coomassie Brilliant Blue G-250) که جز اصلی این روش است به سه فرم کاتیونی (قرمز)، خنثی (سبز) و آنیونی (آبی) وجود دارد. تشکیل کمپلکس رنگ و پروتئین در محیط اسیدی باعث تغییر کوماسی از فرم کاتیونی یا خنثی (رنگ قرمز یا سبز) به فرم آنیونی (رنگ آبی) می‌شود. تشکیل کمپلکس رنگ-پروتئین متاثر از بر هم کنش های الکترواستاتیک گروه های سولفونات رنگ با باقی مانده های اسید آمینه های بازی مانند آرژنین و لایزین است. بر هم کنش های آبگریزی رنگ با باقی مانده های تریپتوفان، فنیل‌آلانین و تیروزین نیز عامل موثر دیگری در تشکیل این کمپلکس است. در شرایط اسیدی رنگ به فرم پروتونه است (Amax = 470 nm) و زمانی که به پروتئین متصل می‌شود به فرم پایدار غیر پروتونه آبی رنگ تبدیل می شود (Amax = 595 nm). ثابت جذب کمپلکس رنگ-پروتئین می تواند تا بیش از ۱۰ برابر غلظت اولیه پروتئین ثابت باقی بماند. بنابراین در این محدوده قانون بیر-لامبرت صادق است و می توان از این طریق غلظت نمونه مجهول را با انتخاب نسبت مناسبی از معرف و نمونه پروتئین به دست آورد.
خلاصه دستورالعمل استفاده از کیت:
پروتکل کیت به شرح زیر خلاصه شده است:
۱- مقدار مورد نیاز از معرف را به نسبت ۱ به ۴ با آب مقطر ترکیب کنید تا به غلظت ۱x برسد.
۲- اجازه دهید نمونه ها و معرف با محیط هم دما شود.
۳- نمونه های استاندارد را مطابق جدول ۱ یا ۲ تهیه کنید.
۴- مطابق جدول ۳ حجم مناسبی از نمونه (یا محلول های استاندارد) را در ۳ تکرار با معرف ترکیب کنید.
۵- نمونه ها را ۱۰ دقیقه در دمای محیط و به دور از نور مستقیم نگهداری کنید. (از فویل آلومینیومی برای پوشاندن میکروتیوب ها یا میکروپلیت استفاده کنید.
۶- با دستگاه اسپکتروفوتومتر، جذب نوری محلول داخل میکروتیوب ها را در طول موج ۵۹۵ نانومتر قرائت کنید.
نکات کلیدی:
- از ظروف کاملا تمیز برای انجام تست استفاده کنید.
- برای رقیق کردن نمونه ها یا تهیه رقت های استاندارد از همان بافری استفاده کنید که نمونه در آن حل شده است. تا تاثیر pH حلال را از تغییر رنگ معرف حذف کنید. به خصوص اگر از بافرهای بازی استفاده می کنید بهتر است نمونه های استاندارد را نیز در همان بافر تهیه کنید.
- به مقدار مورد نیاز از معرف را به غلظت ۱x برسانید. در صورت نگهداری صحیح معرف در ظروف تمیز، دمای ۴C֯ و تاریکی، حداکثر زمان نگهداری معرف در حالت ۱x یک هفته است.
- معرف رنگ می تواند با کووت های کوارتز واکنش دهد. بهتر است از کووت های شیشه ای یا پلاستیکی استفاده کنید. آلودگی های روی ظروف شیشه ای می تواند بر اندازه گیری شما تأثیر بگذارد، قبل از استفاده از تمیز بودن آن ها اطمینان حاصل کنید. اگر از یک کووت برای تمام اندازه گیری ها استفاده می کنید؛ قبل از سنجش نمونه بعدی، رنگ به جا مانده روی بدنه کووت را با گرداندن محلول الکلی در آن تمیز کنید.
- در صورتی که دستگاه اسپکتروفوتومتر یا پلیت ریدر فاقد فیلتر ۵۹۵ نانومتر باشد، جذب نمونه را در هر طول موجی بین ۵۷۰ تا ۶۱۰ نانومتر قرائت کنید.
عیب یابی:
شدت جذب کمتر از حد انتظار:وزن ملکولی پروتئین کم است. حداقل وزن ملکولی مجاز در روش برادفورد ۳۰۰۰-۵۰۰۰ دالتون است. اگر وزن ملکولی پروتئین مورد سنجش کمتر است از روش های دیگری مانند BCA استفاده کنید.
عاملی مداخله گر وجود دارد. نمونه حاوی عاملی مداخله‌گر مانند دترجنت ها است. نمونه پروتئین را با بافر رقیق کنید. از همین بافر برای تهیه رقت های استاندارد استفاده کنید.
شدت جذب بیش از حد انتظار:غلظت پروتئین در نمونه خیلی زیاد است. نمونه را رقیق کنید و تست را تکرار کنید.
عاملی مداخله گر وجود دارد. نمونه حاوی عاملی مداخله گر مانند دترجنت ها است. نمونه پروتئین را با بافر رقیق کنید. از همین بافر برای تهیه رقت های استاندارد استفاده کنید.
مشاهده رنگ آبی تیره در تست برادفورد:غلظت عوامل بازی در نمونه زیاد است. pH نمونه بیش از حد مجاز در تست برادفورد است. نمونه را رقیق یا دیالیز کنید تا از غلظت آن بکاهید.
مشاهده رسوب آبی رنگ در تست برادفورد:غلظت دترجنت ها بیش از حد مجاز است. نمونه را رقیق یا دیالیز کنید تا از غلظت آن بکاهید و مجددا تست را تکرار کنید. در صورتی که رسوب از بین نرفت از روش های دیگر مانند BCA استفاده کنید.
غلظت مجاز مواد مداخله گر را می توانید از مشاهده کنید. نکته دیگر این که اگر اجزای نمونه شما در این لیست وجود ندارد، یا به حضور عاملی مداخله گر در نمونه خود مشکوک هستید می توانید از این روش برای تشخیص آن استفاده کنید: اگر به پروتئین مورد نظر (یا پروتئین استاندارد) به شکل خالص دسترسی دارید، دو منحنی استاندارد رسم کنید، یکی برای پروتئین در بافری که با آن کار می کنید، دیگری برای پروتئین در آب. دو منحنی استاندارد را با هم مقایسه کنید. اگر بافر در اندازه گیری شما تداخل نداشته باشد، دو منحنی استاندارد شیب یکسانی خواهند داشت. در غیر این صورت می‌توانید از سایر تکنیک های موجود استفاده کنید.
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.