سنجش ایمنی وسترن بلات
سنجش ایمنی وسترن بلات یک روش آزمایش سنجش ایمنی است که پروتئین های خاص موجود در خون یا بافت را تشخیص می دهد. این تست یک مرحله الکتروفورز را با یک مرحله ترکیب می کند که پروتئین های جدا شده را بر روی غشا منتقل می کند. وسترن بلات غالباً به عنوان آزمایش پیگیری برای تأیید وجود آنتی بادی و کمک به تشخیص بیماری استفاده می شود. نمونه ای از کاربرد آن شامل آزمایش بیماری لایم است.
برای انجام آزمایش وسترن بلات، یک نمونه حاوی پروتئین به یک نقطه به یک لایه ژل اعمال می شود. چندین نمونه و یک کنترل ممکن است در امتداد یک انتهای ژل در “خطوط” جداگانه قرار گیرند. جریان الکتریکی باعث می شود پروتئین های موجود در نمونه (های) از طریق ژل حرکت کرده و پروتئین ها را از نظر اندازه و شکل از هم جدا کرده و باندهایی را تشکیل دهند که به نردبان شباهت دارند. سپس این نردبان های نمونه و کنترل روی یک غشای نازک که در تماس با ژل قرار دارد، “بلات” (انتقال) می یابند. سپس آنتی بادی های دارای برچسب در یک یا دو مرحله برای شناسایی پروتئین های متصل به غشا استفاده می شود. به عنوان مثال، برای تأیید آزمایش های آنتی بادی HIV یا Lyme، پروتئین های نمونه از ارگانیسم های ایجاد کننده هستند. بعداً توسط آنتی بادی های برچسب دار ایمونوگلوبولین های انسانی شناسایی می شود. حضور پروتئین های خاص با مقایسه با نمونه های کنترل منفی یا مثبت شناخته شده در سایر خطوط تفسیر می شود.
سنجش ایمنی وسترن بلات
آزمایشات وسترن بلات را می توان در چندین قالب انجام داد، که بیشتر آنها به یک آنتی بادی ثانویه کونژوگه نیاز دارند تا به عنوان مولکول گزارشگر عمل کند. مولکول های گزارشگر شامل آنزیم های ترب پراکسیداز، آلکالین فسفاتاز و فلوروفورها هستند. هنگامی که از آنزیم های گزارشگر استفاده می شود، می توان از بسترهای کروموژنیک یا لومینسانس برای تشخیص استفاده کرد.
مولکول های گزارشگر فلوروفور به بستر نیاز ندارند اما برای جمع آوری اطلاعات به تجهیزات ویژه ای نیاز دارند. تشخیص فلورسنت برای آزمایش های WB مالتی پلکس که در آن چندین هدف را می توان در همان روش با استفاده از ترکیبات فلوروفور با طیف های انتشار غیر همپوشانی تشخیص داد، مناسب است. فلورسنت WB همچنین برای تجزیه و تحلیل کمی ایده آل است زیرا تشخیص اجازه می دهد دامنه دینامیکی گسترده ای داشته باشید و عادی سازی سیگنال را فراهم کند.
انتخاب غشای WB به نوع آزمایش بستگی دارد. غشاهای رایج مورد استفاده نیتروسلولز یا پلی وینیل دی فلوئورید (PVDF) است. استفاده از نیتروسلولز آسان است و داده های مناسبی را برای آزمایشهای معمول گزارشگر آنزیمی فراهم می کند. غشا PVDF با فلورسنت کم برای کاربردهای فلورسنت وسترن بلات توصیه می شود.
سنجش ایمنی وسترن بلات چند لیزیتی
از آنجا که دستورالعمل ها و استانداردهای مخصوص برنامه برای اعتبار سنجی آنتی بادی های تحقیقاتی به طور فزاینده ای مورد بررسی جامعه علمی قرار می گیرد، می توان رویکردهای متعددی را اجرا کرد و باید ویژگی یک آنتی بادی اولیه را با قدرت کافی نشان دهد. یکی از این روشها تأیید خصوصیات آنتی بادی هدف خاص با در نظر گرفتن پانلهای چند لیزاتی از سلولهای شناخته شده برای بیان یا عدم بیان هدف مورد نظر بر اساس مطالعات ژنومی و پروتئومی است. کنترلهای منفی مناسب برای سلولهایی که به طور طبیعی هدف را تولید می کنند، همان سلولهایی هستند که در آنها با تحریک شیمیایی یا رویکردهای ژنتیکی ، فراوانی هدف به طور انتخابی تغییر می یابد.
رسوب ایمنی-سنجش ایمنی وسترن بلات
رسوب ایمنی (IP) یکی از روشهای پرکاربرد برای تصفیه و تشخیص آنتی ژن است. این روش از آنتی بادی های خاص آنتی ژن برای جداسازی آنتی ژن مورد نظر از یک مخلوط پروتئین پیچیده استفاده می کند که متعاقباً توسط وسترن بلات تجزیه و تحلیل می شود تا مقدار و اندازه نسبی آنتی ژن هدف و یا پروتئین های مرتبط با هدف ارزیابی شود.
تجزیه و تحلیل پروتئین های رسوب یافته ایمنی توسط لکه ایمنی می تواند پیچیده باشد زیرا معرف مورد استفاده برای شناسایی آنتی بادی رنگ آمیزی WB اغلب به زنجیره های سنگین و سبک آنتی بادی های رسوب دهنده متصل می شود. همانطور که در زیر توضیح داده شده است، این مشکل با استفاده از محصولات TrueBlot که آنتی بادی های رنگی را فقط از طریق افزایش حساسیت، نویز کمتری در زمینه و دقت بیشتر متصل می کنند، به راحتی برطرف می شود.
IP Western blots نتایج کاملاً مشخصی را ارائه می دهد، اما اغلب از لکه های سنگین / سبک، آلودگی و تداخل مداوم رنج می برند.
سنجش ایمنی وسترن بلات In-Cell Western
سنجشهای درون سلولی وسترن (ICW) – یا سنجشهای مبتنی بر سلول ، ELISA درون سلولی (ICE) یا الایزا مبتنی بر سلول سریع فعال شده (FACE) – به محققان اجازه می دهد تا یک روش سنجش ساده و سریع برای نشانگرهای زیستی کمی و با استفاده از آنتی بادی پروتئین ها را در سلولهای کامل علامت گذاری می کند. سیستم تصویربرداری مادون قرمز Odyssey® توسط LICOR® برای ICW مناسب است. اما ممکن است از سیستم های تصویربرداری دیگری نیز استفاده شود. این روش ویژگی یک WB را با ELISA کمی ترکیب می کند. از روشهای ICW می توان برای تشخیص پروتئینها در سلولهای ثابت یا پروتئینهای دارای بافت سلولی مربوط به فیزیولوژیک یا بیولوژیکی و در کمی سازی چند منظوره دو هدف با استفاده از کانالهای 700 نانومتر و 800 نانومتر با آنتی بادی های متصل به رنگ استفاده کرد.
از آنجا که سنجش های ICW مربوط به ایمونوفلورسانس (IF) است ، بیشتر آنتی بادی هایی که برای IF تأیید شده اند می توانند به همین ترتیب با روش های ICW نیز مورد استفاده قرار گیرند.
آنتی بادی های ثانویه برای سنجش ایمنی وسترن بلات
کونژوگه های آنتی بادی ثانویه برای وسترن بلات ایده آل هستند. هنگام انتخاب یک ترکیب آنتی بادی ثانویه برای سنجش آنتی بادی، باید به گونه های هدف، کونژوگه. (به عنوان مثال پراکسیداز ، FITC ، Biotin) و گونه های میزبان توجه شود.
از آنزیم های گزارشگر در زیست شناسی مولکولی بسیار استفاده می شود. زیرا اجازه تجسم یا تشخیص کمپلکس های ایمنی را می دهد. پراکسیداز ترب کوهی (HRP) آنزیمی گزارش دهنده است که به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد. و بسته به بستر آن می تواند یک محصول کروموژنیک یا لومینسانس (شیمی لومینسانس) ایجاد کند. از آلکالن فسفاتاز نیز استفاده می شود که معمولاً به عنوان گزارشگر. در قالب روش وسترن بلات کروموژنیک استفاده می شود.
سنجش ایمنی وسترن بلات
از آنتی بادی های متصل شده به آلکالین فسفاتاز (AP یا Alk Phos) در تشخیص. پروتئین ها در روش های وسترن بلات و سنجش الیزا استفاده می شود. آلکالن فسفاتاز (AP) واکنش های رنگ سنجی را با استفاده از بسترهای. BCIP / NBT یا بستر شیمیایی لومینسانس FemtoMax کاتالیز می کند.
کونژوگه های فلوروکروم نسل بعدی (رنگهای Atto-tec ، DyLight ™ رنگها) جذب برتر (ضریب انقراض بالا)، عملکرد. کوانتومی فلورسانس بالا و قابلیت پایداری بالایی را ارائه می دهند. همه مزدوج ها برای سنجش های مختلف مبتنی بر ایمونوفلورسانس. از جمله بلات وسترن فلورسنت، میکروسکوپ ایمونوفلورسانس، FLISA و غیره ایده آل هستند.
سوبستراها برای سنجش ایمنی وسترن بلات
-
سوبستراهای کروموژنیک
سوبستراهای کروموژنیک در سنجش های رنگ سنجی استفاده می شوند. زیرا منجر به تغییر رنگ قابل اندازه گیری در حضور یک مجموعه آنزیم-آنتی بادی متصل به آنالیزهای خاص می شوند. برای WB با استفاده از پراکسیداز ترب (HRP). در تشخیص رنگ سنجی از لایه های TMB و DAB معمولاً استفاده می شود. سوبستراهای کروموژنیک آلکالن فسفاتاز (AP) شامل BCIP / NBT است. که معمولاً بالاترین حساسیت و تشخیص قابل اعتماد فعالیت AP را نشان می دهد. انتخاب سوبسترا مناسب بستگی به برچسب آنزیم. حساسیت مورد نظر و شکل سیگنال یا روش تشخیص مورد نیاز دارد.
سنجش ایمنی وسترن بلات
واکنش پراکسیداز با بستر TMB یک محصول آبی محلول در آب تولید می کند که می تواند بر روی یک غشا رسوب کند. محصول رسوبنده ، نوارهای آبی تا آبی تیره را در محل آنزیم تولید می کند. TMB به خوبی برای برنامه هایی که به سیگنال به نویز بالا نیاز دارند مناسب است. DAB یکی دیگر از سوبستراهای پراکسیداز است و در حضور HRP و پراکسید رسوبی قهوه ای تولید می کند.
معرف NBT / BCIP نیز معمولاً در روشهای ایمنی سنجی وسترن بلات استفاده می شود. NBT به عنوان یک اکسیدان و BCIP به عنوان بستر قلیایی فسفاتاز عمل می کند. NBT و BCIP با هم واکنش دهنده هایی را در حضور آلکالن فسفاتاز تشکیل می دهند که یک محصول رسوبی بنفش تیره تا سیاه ، محلول در آب را ایجاد می کند و حساسیت شدیدی ایجاد می کند.
-
سوبستراهای شیمیایی
انواع لومینول با شیمی لومینسانس برای تشخیص پراکسیداز ترب (HRP) تولید شده. PicoMax Fem و FemtoMax for برای عملکرد بالا در وسترن بلات طراحی شده اند. و روی غشاهای نیترو سلولز و PVDF کاربردی هستند. FemtoMax chem شیمی لومینسانس تولید می کند. و امکان تشخیص میزان آنتی ژن تا حد فمتوگرام (10-15) را فراهم می کند. روش های تشخیص ممکن است شامل فیلم عکاسی یا سایر روش های تصویربرداری، از جمله. سیستم های مبتنی بر دوربین CCD بسیار حساس باشد.
از طرف دیگر چندین مزیت نسبت به سوبستراهای کروموژنیک دارند. عموماً، این سیستمها بدون استفاده از ایزوتوپهای رادیواکتیو حساسیت بیشتری در تشخیص فعالیت آنزیمی دارند، تشخیص لومینسانس معمولاً در عرض چند دقیقه اتفاق می افتد. و سیگنال قابل اندازه گیری است زیرا به استفاده از دستگاههای شارژ دیجیتال (CCD) ردیابی که محدوده. دینامیکی گسترده ای را با استفاده از قرار گرفتن در معرض طولانی مدت امکان پذیر می کند.
بافرهای مسدود کننده برای سنجش ایمنی وسترن بلات
هنگام انجام وسترن بلات، از بافر مسدود کننده نباید غافل شد. بافر مسدود کننده مکانهایی را در غشا پر می کند که می تواند پروتئین را متصل کرده و در صورت عدم تیمار زمینه ایجاد کند. معرف مهم در یک بافر مسدود کننده پروتئین است، جایی که پروتئین واکنش غیراتصالی با آنتی بادی دارد. پروتئین های مهار کننده محبوب شامل شیر خشک بدون چربی (NFDM)، BSA ، کازئین و ترکیبات آن هستند. توجه داشته باشید، یک عامل مسدود کننده تنها ممکن است برای همه برنامه های وسترن بلات کافی نباشد. برخی از عوامل مسدود کننده می توانند در فعالیت آنتی بادی اولیه تداخل ایجاد. کنند، ممکن است با سیستم گزارشگر مورد استفاده ناسازگار باشد یا خود فلورسانس نامطلوبی ایجاد کند.
بافرهای مسدود کننده فلورسنت به طور خاص برای حفظ فلورسانس از آنتی بادی های ثانویه متصل به رنگ فلوروکروم فرموله شده اند. و همچنین یک زمینه فوق العاده کم در مقایسه با سایر بافرهای مسدود کننده ارائه می دهند.
کیت برای سنجش ایمنی وسترن بلات
ممکن است کیت های وسترن بلات برای سنجش شما در دسترس باشد، و نیازهای شما را ساده می کند. بسیاری از کیت هایی برای قالب های سنجش ایمنی. شیمیایی، فلورسنت و کروموژنیک در وبسایت آرمان بیوتک ارائه داده می شود. پروتکل های ساده و کاربرد آسان برای کاربران مبتدی و متخصص در دسترس خواهد بود.
اولین دیدگاه را ثبت کنید