ROX چیست و چرا باید از آن در qPCR استفاده کرد؟

ROX چیست و چرا باید از آن در qPCR استفاده کرد؟

 استفاده از ROX، آری یا خیر؟ اغلب دانشجویان درباره ماهیت ROX و دلیل استفاده از آن در qPCR سردرگم هستند. بنابراین تصمیم گرفتیم در این مقاله به این موضوع بپردازیم که: « ROX چیست و چرا باید از آن استفاده کنید؟»

.

***برای بررسی و خرید انواع مستر میکس real-time PCR و همچنین انواع مستر میکس معمولی از آرمان بایوتک روی لینک ها کلیک کنید.***

.

ROX چیست؟

ROX، با نام کربوکسی رودامین نیز شناخته می شود. یک رنگ فلورسنت بی اثر است که می تواند به ترکیب اصلی qPCR اضافه شود. برخلاف رنگ های گزارشگر در qPCR (به عنوان مثال SYBR Green)، از ROX به عنوان یک رنگ غیرفعال یاد می شود، زیرا سیگنال فلورسنس آن تحت تأثیر واکنش های PCR نیست. به عبارت دیگر، سیگنال فلورسنت ROX در تمام مراحل qPCR پایدار می ماند و به میزان الگوی واکنش، وابسته نیست.

.

هدف از استفاده از  ROX در qPCR چیست؟

از آنجا که ROX یک رنگ فلورسنت منفعل است، دلیل اصلی استفاده از آن در qPCR عادی سازی سیگنال است. با نرمال سازی سیگنال فلورسنت، می توان تنوع بین تکرارها را کاهش داد.

تغییرات جزئی بین چاهک ها (wells) می تواند سیگنال فلورسنت تولید شده در qPCR را تحت تأثیر قرار دهد. به عنوان مثال، اختلاف در میزان واکنش ناشی از خطای پیپت و پیپتینگ، می تواند باعث ایجاد خطا در نتایج شود. همچنین، عوامل مربوط به تجهیزات qPCR، مانند اپتیک نیز می توانند بر سیگنال فلورسنت تولید شده تأثیر بگذارند.

.

.

برای درک بیشتر درباره چرایی استفاده از ROX، شما می توانید به یک مفهوم مشابه مانند استفاده از ژن های مرجع برای فرآیند نرمال سازی در محاسبات بیان نسبی ژن در روش ΔΔCT فکر کنید. به جای کنترل مقدار الگوی موجود در نمونه، ROX در حال نرمال سازی ویژگی های مخلوط qPCR مانند اختلاف حجم، وجود حباب و غیره است.

برای نرمال سازی سیگنال فلورسنت، سیگنال رنگ گزارشگر توسط سیگنال ROX تقسیم می شود. سپس مقدار جدید به عنوان مقدار گزارشگر نرمال (Rn) شناخته می شود.

.

معمولاً، در نمودارهای تکثیر، دلتا (Δ) Rn در محور y در مقابل تعداد چرخه در محور x رسم می شود. ΔRn تفاوت بین Rn هر نمونه آزمایشی و Rn پایه است. بنابراین، فقط نتایج بالاتر از سیگنال پایه/پس زمینه رسم می شوند.

.

آیا ROX برای qPCR ضروری است؟

جواب کوتاه، نه است. لازم نیست ROX را به مخلوط qPCR خود اضافه کنید. با این حال، افزودن آن می تواند به کاهش تغییرات یا variation مقادیر فلورسنت در نمونه ها کمک کند، که در نهایت بر نتایج بیان ژن تأثیر می گذارد.

نکته مهم دیگر این است که استفاده از ROX به دستگاه qPCR مورد استفاده شما بستگی دارد. همیشه قبل از انجام qPCR بررسی کنید آیا دستگاه شما با اندازه گیری ROX سازگار است یا خیر. بعضی از دستگاه ها واکنش با ROX بالا (High ROX) را ترجیح می دهند، در حالی که بعضی دیگر واکنش های با ROX پایین (Low ROX) را ترجیح می دهند.

.

از تنظیم صحیح دستگاه qPCR اطمینان حاصل کنید.

• اگر تصمیم دارید از این رنگ در مخلوط واکنش خود استفاده کنید، فراموش نکنید که ROX را به عنوان رنگ غیرفعال انتخاب کنید. در این صورت، دستگاه هیچ داده ای برای این کانال ثبت نمی کند.

• به همین ترتیب، اگر تصمیم به استفاده از ROX ندارید، هیچ کانالی را برای اندازه گیری ROX انتخاب نکنید. دستگاه می تواند ROX را موجود بداند و نویز پس زمینه را ضبط کند، که به دلیل نرمال سازی نادرست می تواند بر نتایج شما تأثیر بگذارد.

دستگاه های متداول در real-time و میزان ROX

* برای دانلود فرمت با کیفیت جدول بالا کلیک کنید.

.

سازگاری دستگاه ها با ROX

.

هنگام تعیین کمیت اسیدهای نوکلئیک از طریق  PCR (qPCR) کمی، دقت و تکرار پذیری بالا ضروری است. با این حال، عواملی مانند خطای پیپتینگ و طراحی ابزار (به طور خاص کمبود یکنواختی حرارتی یا نوری در پلیت واکنش) می تواند منجر به تغییراتی در اندازه گیری فلورسانس شود.

چرا باید از آن در qPCR استفاده کرد؟

خطای پیپتینگ، یک خطای انسانی غالباً اجتناب ناپذیر است که هنگام استفاده از این ابزار بوجود می آید. به طور خاص، طراحی نوری برخی از سیستم های qPCR مسیرهای نوری و تشخیص را ایجاد می کند که برای هر چاهک از بلوک سیکلر حرارتی، متفاوت است. تغییر در طول مسیر نور، باعث ایجاد اختلاف در مییزان فلورسانس مطلق در چاهک هایی می شود که حاوی غلظت یکسان فلوروفور گزارشگر هستند. یک چاهک با مسیر نور کوتاه تر، که معمولا در وسط بلوک قرار دارد، در مقایسه با چاهکی که در اطراف بلوک قرار دارد و مسیر نور طولانی تری دارد، خوانش فلورسانس بیشتری خواهد داشت.

برای به حداقل رساندن چنین عواملی، از نرمال سازی سیگنال واکنش در سطح اولیه استفاده می شود. بدین منظور از یک رنگ مرجع منفعل استفاده می شود که همان طور که از نامش پیداست در تکثیر PCR شرکت نمی کند یا تداخلی ایجاد نمی کند. این رنگ قبل از توزیع در چاهک ها، به ترکیب اصلی واکنش اضافه می شود. در طول چرخه های حرارتی، سیگنال رنگ مرجع و سیگنال های مربوط به نمونه، از کانال های جداگانه مربوط به خود شناسایی می شوند.

به طور خلاصه، واضح است که رنگ های مرجع منفعل، با سیستم های مختلف qPCR خود، بخش اساسی از سوپرمیکس ها هستند.

• مطالعه بیشتر
• محصولات مرتبط با PCR, qPCR & RT-PCR