راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

مقدمه

سنجش های ایمونوسوربنت با اتصال آنزیم (ELISA) با استفاده از آنتی بادی ها و آنتی ژن های همراه با آنزیمی که به سادگی قابل سنجش است، ویژگی آنتی بادی ها را با حساسیت سنجش های ساده آنزیمی ترکیب می کنند. ELISA می تواند اندازه گیری مفید غلظت آنتی ژن یا آنتی بادی را ارائه دهد. ELISA به عنوان یكی از حساس ترین سنجش های ایمنی، ارزش تجاری در تحقیقات آزمایشگاهی، تشخیص علامت های زیستی بیماری و كنترل كیفیت را در صنایع مختلف ارائه می دهد.

با توجه به روش تشخیص آنالیز، انواع مختلف الایزا وجود دارد. هر یک از آنها پروتکل خاص خود را دارند اما اصل اساسی مشابه آن است. ELISA یک روش پنج مرحله ای است:

1) فیکس آنتی ژن در سطح پلیت؛

2) مسدود کردن همه سایتهای غیرمجاز برای جلوگیری از جذب غیر اختصاصی.

3) افزودن آنالیز و انکوباسیون؛

4)  آنتی بادی برچسب دار و انکوباسیون.

5) اضافه کردن سوبسترا برای رنگ آمیزی/ لومینسانس

 

ما قبلاً در مورد الایزا و پروتکل عمومی در راهنمای الیزا و راهنمای توسعه الیزا بحث کردیم. در اینجا ما عمدتا در مورد برخی از دانش اساسی و نکات عملی در طول روند عملکرد ELISA صحبت  می کنیم. اگر در مورد کیت تجاری ELISA به اطلاعات بیشتری نیاز دارید، لطفاً از محصولات کیت ELISA ما دیدن کنید.

 

1- پلیت الایزا (فاز جامد) – ELISA Plate

انواع مختلفی از فاز جامد وجود دارد که می تواند برای الیزا استفاده شود، مانند غشا، چاهک های پلیت و مهره ها. خصوصیات آنها در جدول زیر شرح داده شده است.

                                            جدول 1. انواع فاز های جامد سنجش ایمنی

Materiala Binding Capacity Type of Interaction
Membrane
Nitrocellulose
PVDF
Nylon
High
High
High
Hydrophobic, Hydrophilic
Hydrophobic
Hydrophobic
Plates and tubes
Polystyrene
Polyvinyl
Low
Low
Hydrophobic
Hydrophobic
Beads
Polystyrene
Derivatized polystyrene
Microparticles
Moderate
High
High
Hydrophobic
Covalent, Hydrophobic, Hydrophilic
Covalent and Hydrophobic

معمولاً الایزا در پلیت های 96 چاهک (یا 384 چاهک) انجام می شود. بیشتر صفحات یا پلی استایرن هستند یا مشتقات پلی استایرن که با اصلاح شیمیایی یا تابش سطح بدست می آیند. پروتئین گیرنده می تواند به صورت منفعل در سطح صفحه پلی استایرن جذب شود و یا از طریق کووالانسی با تغییراتی که گروههای آمینی یا واکنشی مانند مالایمید، هیدرازین یا N-oxysuccinimide روی سطح باقی می گذارد، جذب شود (شکل 1).

همین اتصال و فیکس شدن معرف ها است که طراحی و اجرای ELISA را بسیار آسان می کند. فیکس شدن واکنش دهنده های ELISA به سطح میکروپلیت، جداسازی متصل شده از مواد عیرمتصل را در طول آزمایش آسان می کند. این توانایی برای شستشوی مواد متصل غیراختصاصی، ELISA را به ابزاری قدرتمند برای اندازه گیری آنالیتهای خاص در داخل یک ماده خام تبدیل می کند.

 

antibody, ELISA, آنتی بادی, الایزا, کیت الایزا
شکل 1- سطح شیمیایی صفحه پلی استایرن و پروتئین فیکس شده.

پلی استایرن بسته به غلظت آنها در محلول فیکس کننده (coating buffer)، طیف گسترده ای از پروتئین ها را به میزان فزاینده ای متصل می کند. مقدار مشخص و بهینه برای هر پروتئین باید تعیین شود. کربوهیدرات ها و پروتئین های به شدت گلیکوزیله شده توسط نیروهایی که در بالا توضیح داده شد به خوبی به پلی استایرن جذب نمی شوند زیرا آنها توانایی بسیار کمی برای شرکت در فعل و انفعالات آبگریز دارند. برای چسبیدن به این مولکول ها، باید با پیوندهای کووالانسی متوسل شد.

تعدادی تغییر در سطح پلی استایرن اعمال شده است که امکان پیوند کووالانسی مولکولها با سطح پلاستیک را فراهم می کند (شکل 1c). گروه های مالئیمید با یک سولفیدریل واکنش نشان می دهند و یک پیوند کووالانسی بین سطح پلاستیک و یک پروتئین یا پپتید ایجاد می کند. هیدرازین با آلدهیدهای حاصل از اکسیداسیون پریودات کربوهیدرات ها واکنش نشان می دهد. N-Hydroxysuccinimide (NHS) با آمین های موجود در پپتیدها یا پروتئین ها واکنش نشان می دهد. پپتیدها یا از طریق COOH با استفاده از یک اتصال دهنده متقاطع مانند carbodiimide یا از طریق آمین با استفاده از یک اتصال متقابل homobifunctional مانند disuccinimidyl suberate (DSS) اتصال می یابند. جدول 2 روش پیشنهادی برای کوت کردن آنتی ژنهای مختلف در صفحه پلی استایرن را نشان می دهد.

                                                                جدول 2. آنتی ژن های مختلف و روش کوت کردن توصیه شده آنها.

Direct Adsorption Covalent Linkage
Proteins
Peptides longer than 15-20 amino acids
Small molecule epitopes attached to a protein
Bacteria and virus
Heavily glycosylated proteins
Proteins in the presence of detergents
Carbohydrates
Short Peptides
Lipids
DNA

راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

2- کوت کردن آنتی ژن

یکی از ویژگی های اصلی الایزا مبتنی بر پلیت این است که پروتئین گیرنده (آنتی بادی یا آنتی ژن) می تواند با جذب غیرفعال یا پیوند کووالانسی به راحتی به سطوح متصل شود. به این فرآیند معمولاً کوت گفته می شود. عوامل متعددی بر روند کوت آنتی ژن تأثیر می گذارند. میزان پوشش بیشتر به عوامل زیر بستگی دارد:

  •  ضریب انتشار مولکول مورد اتصال
  • نسبت سطح پوشش داده شده به حجم محلول کوت کننده
  • غلظت آنتی ژن جذب شده
  • درجه حرارت
  • زمان جذب

این عوامل بهم پیوسته اند. تعیین غلظت مطلوب پوشش آنتی ژن برای هر سیستم از بیشترین اهمیت برخوردار است. زمان و دما نیز از فاکتورهای مهم کنترل کننده میزان جذب پروتئین هستند. دامنه غلظت 1-10 میکروگرم در میلی لیتر پروتئین، در حجم 50-100 میکرولیتر ، راهنمای خوبی برای سطح پروتئین مورد نیاز برای اشباع مکانهای موجود در صفحه پلی استایرن است. محلولهای کوت کننده معمولاً مورد استفاده عبارتند از: 50 میلی متر کربنات ، pH 9.6 ؛ 20 میلی مولار Tris-HCl ، pH 8.5 ؛ و 10 میلی مولار PBS ، pH 7.2..

کامل ترین جذب و کمترین تغییر چاهک به چاهک در طی یک شبانه روز (16-18 ساعت) در دمای 4 درجه سانتیگراد با چاهک های مهر و موم شده برای جلوگیری از تبخیر رخ می دهد. زمان جذب را می توان با انکوباسیون در دمای اتاق به مدت 4-8 ساعت یا 37 درجه سانتیگراد برای 1-4 ساعت افزایش داد. تنوع بسیار بیشتری وجود دارد و در نهایت، هر محققی باید یک آنتی ژن خاص را تیتر کند تا یک پروسه استاندارد بدست آورد. پس از فرآیند کوت کردن، فراموش نکنید که محلول کوت کننده را خارج کنید و پلیت را با پر کردن چاهک ها با 200μl PBS به مدت 3 بار بشویید. سپس محلول های شستشو را با زدن آرام پلیت روی ظرفشویی بردارید. با لمس پلیت روی حوله کاغذی ، قطره های باقیمانده را بردارید.

راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

3- روند مسدود کردن یا Blocking

پوشش چاهک ها با شریک اتصال خاص، آنتی ژن یا آنتی بادی، مکان های آبگریز خالی را در پلاستیک باقی می گذارد. این سایت ها باید مسدود شوند تا از اتصال غیر اختصاصی واکنش دهنده های بعدی جلوگیری شود. اگر این امر به طور موثر انجام نشود، آزمایش دارای سیگنال پس زمینه بالا و پایین آمدن ویژگی و حساسیت خواهد بود (شکل 2). این بلاکرها با کاهش اتصال غیر اختصاصی برای افزایش نسبت سیگنال به نویز کار می کنند. برای جلوگیری از اتصال غیر  اختصاصی، از بافرهای مسدود کننده پس از مرحله پوشش فاز جامد برای جلوگیری از باقی مانده محل اتصال باز استفاده می شود.

antibody, ELISA, آنتی بادی, الایزا, کیت الایزا
شکل 2- بلاکینگ

معرف های مسدود کننده معمولاً به روشی تجربی انتخاب می شوند. مسدود کننده مطلوب برای یک روش ممکن است در سنجش های دیگر عملکرد خوبی نداشته باشد. دو کلاس عمده عوامل مسدود کننده که آزمایش شده اند ، پروتئین ها و شوینده ها هستند.

                                   جدول 3. مزایا و معایب مسدودکننده های پروتئینی که معمولاً استفاده می شوند          

Blockers Preparation Advantages Disadvantages
Bovine serum albumin (BSA) 1%~5% in PBS at pH 7 Inexpensive
Stored dry or as a sterile solution at 4°C.
Compatibility with Protein A
Cross-reactions with anti-BSA-hapten conjugates.
lack of diversity required to block some covalent surfaces
Lot-to-lot variability
Non-fat dry milk (NFDM) 0.1%~0.5% Relatively inexpensive
compatible with Protein A
Lot-to-lot variability
Tendency to deteriorate rapidly
Casein or caseinate 1%~5%. Main component of NFDM lacks of the impurities Same as NFDM
Whole Sera 5%~10% Molecular diversity
Effectively blocks non-specific reaction
cross-reactivity with Protein A and anti-IgG antibodies
Fish Gelatin 1% ~ 5% Lack of cross reactivity with mammalian antibodies and Protein A Lot-to-lot variability
Least effective biomolecule surface blocker

 

عوامل مسدود کننده ایده آل دارای ویژگی های زیر هستند:

  • اتصال غیر اختصاصی واکنش دهنده های سنجش به سطح چاهک را به طور موثر مسدود کند
  • اتصال اجزای سنجش که به چاهک جذب شده اند را مختل نکند
  • به عنوان تثبیت کننده (جلوگیری از دناتوراسیون) واکنش دهنده های سنجش روی فاز جامد عمل کنید
  • با سایر واکنش دهنده های سنجش واکنش متقابل نداشته باشد
  • فعالیت آنزیمی که ممکن است به تولید سیگنال یا تخریب واکنش دهنده ها کمک کند ، نداشته باشد
  • درتستهای مختلف به طور مداوم اجرا شود

 

4- آماده سازی آنتی بادی

از آنجا که آنتی بادی ها سنگ بنای آزمایش ELISA هستند ، بدیهی است که انتخاب آنتی بادی ها از اهمیت بالایی برخوردار است. بیشترین مشکلاتی که وجود دارد این است که چگونه می توان یک آنتی بادی ، مونوکلون (MAb) یا پلی کلون (PAb) انتخاب کرد؟ به طور کلی ، یک MAb اغلب به عنوان آنتی بادی اولیه برای ایجاد بالاترین سطح اختصاصی در یک روش و PAb به عنوان آنتی بادی ثانویه برای تقویت سیگنال از طریق چندین رویداد اتصال انتخاب می شود. با این حال، از هر ترکیبی می توان استفاده کرد. همه آنتی بادی های کاندید باید همراه با نوع نمونه مورد نظر آزمایش شوند تا بهترین عملکردها انتخاب شود.

آنتی بادی اولیه / ثانویه باید در محلول مسدود کننده رقیق شود تا از اتصال غیر اختصاصی جلوگیری کند. غلظت 0.1-1.0 میکروگرم در میلی لیتر معمولاً کافی است.

اگر به آنتی بادی با کیفیت بالا نیاز دارید، به خدمات تولید آنتی بادی مونوکلونال و خدمات تولید آنتی بادی پلی کلونال مراجعه کنید.

                                                             MAb و PAb  جدول 4. تفاوت عملکرد کلیدی بین

Monoclonal antibodies (MAb) Polyclonal antibodies (PAb)
a. Generally produced in mice or recombinantly, these antibodies recognize a single epitope.
b. Since only one antibody molecule can bind to the antigen, the interaction is highly specific but can lack sensitivity.
a. Produced in goats, sheep, chicken, rabbits and other animals.
b. Polyclonal sera is a heterogepneous composite of antibodies with unique specificities and the concentration of specific antibody (PAb) is typically 50-200mg/mL.
c. PAbs are able to recognize multiple epitopes on any one antigen which makes them less sensitive to antigen mutational changes.
d. PAbs are useful when the nature of the antigen is not well known. However, their quantity is limited by the lifespan of the animal.

 

5- آماده سازی نمونه

نمونه ها حاوی آنالیزهای اصلی هستند که باید توسط ELISA شناسایی کنیم. تهیه عالی محلول نمونه ممکن است کیفیت آزمون ELISA را بهبود بخشد. نوع نمونه می تواند انواع مختلفی از قبیل سرم ، پلاسما ، ادرار ، محلول های سلول یا بافت ، بزاق ، شیر ، ماده مایع رویی کشت سلول و غیره باشد. هر نمونه ممکن است به یک فرآیند آماده سازی خاص نیاز داشته باشد. یک پروتکل کلی برای تهیه نمونه به شرح زیر:

آ. غلظت عصاره پروتئین حداقل 1-2 میلی گرم در میلی لیتر است.

ب عصاره های سلولی و بافتی 50 درصد با بافر اتصال رقیق می شوند.

ج نمونه ها با دور 10،000 دور در دقیقه و به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ می شوند تا رسوبات قبل از استفاده از بین بروند.

 برای جزئیات هر نمونه ، به جدول 5 مراجعه کنید. راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

                                         ELISA جدول 5-و روشهای تیمار آنها  انواع نمونه های متداول

Samples Treatments
Serum Collect whole blood into a tube without additives; Keep at room temperature for 20 minutes. Centrifuge 10 minutes at 3,000 rpm. Aliquot into small tubes and store at -80°C until use. Minimize freeze/thaw cycles.
Plasma Collect whole blood into an EDTA, Citrate or Sodium heparin tube; Centrifuge 10 minutes at 3,000 rpm at 4°C; Aliquot into small tubes and store at -80°C until use. Minimize freeze/thaw cycles.
Urine Collect urine without adding stabilizers. Centrifuge the samples hard (eg. 10,000 x g for 1 min or 5,000 x g for 2 min).       Aliquot, quick freeze in dry ice/methanol bath, and store at -80°C until use.
Saliva Collect samples and centrifuge at 10,000 x g for 2 min at 4°C.  Aliquot supernatant and store samples at -80°C. Minimize freeze/thaw cycles.
Cell lysates Place tissue culture plates on ice. Remove the media and gently wash cells once with ice-cold PBS. Remove the PBS and add 0.5 ml extraction buffer per 100 mm plate. Tilt the plate and scrape the cells into a pre-chilled tube. Vortex briefly and incubate on ice for 15-30 min. Centrifuge at 13,000 rpm for 10 min at 4°C (this creates a pellet from the insoluble content). Aliquot the supernatant into clean, chilled tubes (on ice) and store samples at -80°C, avoiding freeze/thaw cycles.
Tissue lysates Dissect the tissue of interest with clean tools, on ice preferably and as quickly as possible to prevent degradation by proteases. Place the tissue in round bottom microfuge tubes and immerse in liquid nitrogen to “snap freeze”. Store samples at -80°C for later use or keep on ice for immediate homogenization. For a ~5 mg piece of tissue, add ~300 μL complete extraction buffer to the tube and homogenize with an electric homogenizer. Rinse the blade twice using 300 μL complete extraction buffer for each rinse, then maintain constant agitation for 2 h at 4°C. Centrifuge for 20 min at 13,000 rpm at 4°C. Place on ice, aliquot supernatant (this is the soluble protein extract) to a fresh, chilled tube and store samples at -80°C. Minimize freeze/thaw cycles.
Cell culture supernatants Centrifuge cell culture media at 1,500 rpm for 10 min at 4°C. Aliquot supernatant immediately and hold at -80°C, avoiding freeze/thaw cycles.

6- محلول بافر راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

به طور عمده 5 محلول بافر در آزمون ELISA استفاده می شود: بافر پوشش ، بافر مسدود كننده ، بافر شستشو ، بافر بستر و بافر استاپ. بافر پوشش معمولاً 05/0 میلی متر بافر کربنات با pH = 6/9.

                                                                                  جدول 6

Coating buffer Blocking buffer Washing buffer Substrate buffer Stop buffer
0.05M carbonate buffer, pH=9.6 See Table3 0.01M PBS-Tween 20, pH=7.4 Phosphoric-citric acid buffer, pH=5.0 2M H2SO4
Na2CO3 1.59g NaCl 8g 0.2M Na2HPO4 25.7mL
NaHCO3 2.93g KH2PO4 0.5g 0.1M Citric acid 24.3mL
ddH2O 1000mL Na2HPO4 2.9g ddH2O 50mL
adjust pH to 9.6 Tween 20 0.5mL OPD(Substrate) 4mg
storage in 4°C ddH2O add to 1000mL 30% H2O2 0.015mL

7-مراحل شستشو

انکوباسیون هایی که در یک روش ELISA انجام می شود، باعث می شود که فعل و انفعالات خاص با میل بالا در میان واکنش دهنده ها ایجاد شود. با شستشوی چندین بار بین هر انکوباسیون، واکنش دهنده های اضافی در سطح پس زمینه رقیق می شوند. به منظور رقیق سازی واکنش دهنده های اضافی، لازم است 3-5 بار بعد از هر انکوباسیون بشویید. همچنین بهتر است در هر مرحله شستشو اجازه دهید 5 تا 10 دقیقه با بافر شستشو خیس بخورد. اگر مراحل شستشو با دست انجام می شود، با ضربه پلیت به حوله های کاغذی خشک ، بافر اضافی شستشو را در هر مرحله بیرون بریزید. به مدت طولانی بین مراحل شستشو اجازه ندهید که صفحه خشک شود زیرا این امر منجر به کاهش فعالیت می شود.

8- تجزیه و تحلیل داده ها راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

روش ELISA سه نوع مختلف از داده های خروجی را ارائه می دهد:

  • کمی: داده های ELISA را می توان در مقایسه با یک منحنی استاندارد (رقت سریال یک آنتی ژن شناخته شده ، خالص شده) تفسیر کرد تا غلظت آنتی ژن در نمونه های مختلف دقیق محاسبه شود.
  • کیفی: همچنین می توان از الایزا برای دستیابی به پاسخ بله یا خیر استفاده کرد که نشان می دهد آنتی ژن خاصی در نمونه وجود دارد، در مقایسه با یک چاهک خالی که حاوی آنتی ژن یا آنتی ژن کنترل غیرمرتبط نیست.
  • نیمه کمی: از الایزا می توان برای مقایسه سطح نسبی آنتی ژن در نمونه های آزمایش استفاده کرد، زیرا شدت سیگنال به طور مستقیم با غلظت آنتی ژن متفاوت خواهد بود.

داده های ELISA معمولاً با تراکم نوری در مقابل غلظت ورود به سیستم برای تولید یک منحنی سیگموئیدی نمودار می شود. از غلظت های شناخته شده آنتی ژن برای تولید یک منحنی استاندارد استفاده می شود و سپس از این داده ها برای اندازه گیری غلظت نمونه های ناشناخته در مقایسه با قسمت خطی منحنی استاندارد استفاده می شود (شکل 3).

antibody, ELISA, آنتی بادی, الایزا, کیت الایزا

                           شکل 3. منحنی استاندارد ELISA.

نکته مهم: ما اینجا هستیم تا کمک کنیم! راهنمای عملی اجرای بهتر ELISA

علاوه بر این، ما لینک های راهنمای ELISA ایجاد کرده ایم که فکر می کنیم ممکن است برای شما مفید باشد!

لینک های مفید:
دیدگاه شما
محصول با موفقیت به سبد خرید اضافه شد.