تفاوت بین PCR، RT-PCR و qPCR

تفاوت بین PCR، RT-PCR و qPCR

.

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز یک ابزار بیوتکنولوژیکی برای تکثیر ژن مورد نظر است. برای تشخیص و تکثیر ژن از PCR ساده استفاده می شود. روش های پیشرفته مختلفی برای PCR وجود دارد که برای اهداف مختلف تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می شود. qPCR یا PCR کمی به عنوان Real Time PCR نیز شناخته می شود. qPCR برای تعیین کمیت اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود. تکثیر مولکول DNA را می توان در طول PCR، با روش real-time PCR یعنی در زمان واقعی، بررسی کرد.

RT-PCR یک واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس نامیده می شود که از هر دو فرآیند، یعنی رونویسی معکوس و واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده می کند. از این روش برای تشخیص و اندازه گیری مقدار RNA استفاده می شود.

.

جدول زیر تفاوت های اصلی بین PCR و qPCR یا Real-time PCR را نشان می دهد.

.

در RT-PCR از RNA به عنوان الگو استفاده می شود. ازین روش برای تجزیه و تحلیل و تکثیر یک قطعه کوتاه RNA استفاده می شود. RNA ابتدا با رونویسی معکوس به DNA مکمل یا cDNA تبدیل می شود و سپس روش استاندارد PCR دنبال می شود. در RT-qPCR، رونوشت‌ های RNA ابتدا با انجام رونویسی معکوس ایجاد می‌شوند و سپس qPCR استاندارد انجام می‌شود.

.

PCR چیست؟

واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR برای تکثیر یا تولید چندین نسخه از یک ژن یا تکثیر بخش کوتاهی از DNA استفاده می شود. این متد توسط Kary Mullis ابداع شد. این تکنیک ابزار بسیار مفیدی در زیست شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی است. در آزمایشگاه ها برای ساخت میلیاردها نسخه از DNA برای تحقیقات و تشخیص استفاده می شود.

سه مرحله در PCR وجود دارد: دناتوراسیون، انیلینگ پرایمر و گسترش پرایمرها.

برای انجام این مراحل به یک جفت پرایمر که به هر دو انتهای DNA الگو بچسبند و یک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت نیاز است. چرخه پلیمراز چندین بار تکرار می شود تا چندین نسخه از قطعه DNA بدست آید.

سه مرحله واکنش زنجیره ای پلیمراز عبارتند از:

دناتوراسیون:

در این مرحله DNA دو رشته ای جدا می شود. تک رشته DNA تشکیل می شود.

Annealing:

دمای واکنش کاهش می یابد تا امکان جفت شدن پرایمر و الگو فراهم شود.

Extension:

در این مرحله از یک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت مثل Taq polymerase استفاده می شود. DNA پلیمراز، نوکلئوتیدها را به پرایمر اضافه می کند و رشته مکمل را در جهت 3′ به 5′ گسترش می دهد.

.

qPCR چیست؟

نام دیگر qPCR یا PCR کمی، Real-time PCR است. همان طور که از نام آن پیداست، در qPCR یا Real-time PCR، می توان با پیشرفت PCR، در لحظه میزان تکثیر را بررسی کرد. در qPCR، برچسب‌ گذاری فلورسنت امکان جمع‌ آوری بی‌ درنگ داده‌ها را هم زمان با انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز فراهم می‌کند.

محصولات PCR را می توان در زمان واقعی در qPCR با دو روش شناسایی کرد:

1- استفاده از رنگ های فلورسنت غیر اختصاصی که به تشخیص DNA دو رشته ای کمک می کند. رنگ متصل به dsDNA، همزمان با تکثیر DNA سیگنال های فلورسانس می دهد. این سیگنال ها پس از هر چرخه افزایش می یابند. نقطه ضعف این روش این است که تنها یک هدف را می توان در یک زمان بررسی کرد زیرا به تمام قطعات dsDNA متصل می شود.

2- استفاده از پروب های DNA نشاندار شده با فلورسنت، که توالی خاص هستند. آن ها را می توان پس از هیبریداسیون با توالی مکمل آن تشخیص داد. از آن جایی که کاوشگرهای DNA خاص هدف هستند، بسیاری از اهداف را می توان به طور ه مزمان تجزیه و تحلیل کرد.

.

RT-PCR چیست؟

RT-PCR یا PCR رونویسی معکوس شامل دو مرحله است، اول فرآیند رونویسی معکوس و دوم تکثیر توالی DNA مورد نظر توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR. از این روش برای تشخیص RNA در یک نمونه استفاده می شود. مقدار RNA را می توان با استفاده از RT-qPCR اندازه گیری کرد. RT-PCR همراه با qPCR (RT-qPCR) در انجام تجزیه و تحلیل کمی RNA ویروسی و بیان ژن بسیار مفید است.

مراحل RT-PCR مانند PCR است اما در ابتدای کار یک مرحله رونویسی معکوس به آن اضافه می شود. در RT-PCR، ابتدا یک DNA مکمل (cDNA) با استفاده از یک رونوشت معکوس (RT) تولید می شود. cDNA تشکیل شده، سپس به عنوان یک الگو برای فرآیند تکثیر استاندارد توسط PCR استفاده می شود.

به طور خلاصه، RT-PCR و qPCR روش های پیشرفته PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز هستند. qPCR نتایج سریع‌ تر و دقیق‌ تری در زمان واقعی ارائه می‌دهد و برای تعیین کمیت اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود. RT-PCR برای شناسایی و تکثیر cDNA استفاده می شود.