آشنایی با مراحل مختلف آزمون PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک پرکاربرد در زیست شناسی مولکولی است که امکان تقویت یک توالی DNA خاص را فراهم می کند. این ابزار قدرتمند عرصه بیوتکنولوژی را متحول کرده است و کاربردهای متعددی در تحقیقات، تشخیص و پزشکی قانونی دارد. فرآیند PCR شامل چندین مرحله است که برای تکثیر موفقیت آمیز DNA هدف بسیار مهم است. در این مقاله به طور مفصل به مراحل مختلف PCR می پردازیم.

1. فهرست

   Toggle

   مرحله اول – واسرشت سازی ( Denaturation )

اولین مرحله PCR دناتوراسیون یا واسرشت سازی است که در آن الگوی DNA دو رشته ای تا دمای بالا (معمولاً حدود 95 درجه سانتیگراد) گرم می شود. این گرما باعث می شود که پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته شکسته شود و در نتیجه DNA به دو رشته منفرد جدا شود. دناتوره کردن یک مرحله حیاتی است زیرا به پرایمرها اجازه می دهد تا در مرحله بعدی به توالی DNA هدف متصل شوند.

2. مرحله دوم – اتصال پرایمر ها به رشته های منفرد ( Annealing )

پس از دناتوره شدن، دما کاهش می‌یابد تا به پرایمرها اجازه داده شود به توالی‌های مکمل روی هر الگوی DNA تک رشته‌ای متصل شوند. دمای آنلینگ معمولاً حدود 50 تا 65 درجه سانتیگراد است که بستگی به طول و ترتیب پرایمرها دارد. طراحی پرایمر مناسب برای آنلینگ کارآمد به توالی DNA هدف ضروری است.

3. مرحله سوم – گسترش ( Extension )

هنگامی که پرایمرها به DNA الگو متصل شدند، دما به حدود 72 درجه سانتیگراد افزایش می یابد که برای فعالیت DNA پلیمراز بهینه است. در طول این مرحله، آنزیم DNA پلیمراز با افزودن نوکلئوتیدها به انتهای 3′ هر آغازگر، پرایمرها را گسترش می دهد و یک رشته DNA مکمل جدید را سنتز می کند. این فرآیند منجر به تقویت توالی DNA هدف می شود.

4- مرحله چهارم – تکرار چرخه ( Cycling )

سه مرحله دناتوراسیون، آنلینگ و گسترش چندین بار در فرآیندی به نام چرخه تکرار می شوند. هر چرخه مقدار DNA موجود را دو برابر می کند و در نتیجه توالی هدف تقویت می شود. تعداد چرخه های مورد نیاز به مقدار اولیه DNA و سطح مورد نظر تقویت بستگی دارد.

5- مرحله نهایی – Final extension

پس از چندین چرخه دناتوراسیون، آنلینگ و گسترش، یک مرحله گسترش نهایی گنجانده شده است تا اطمینان حاصل شود که DNA تک رشته ای باقیمانده به طور کامل گسترش یافته است. این مرحله معمولاً 10-5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد طول می کشد تا از سنتز کامل تمام قطعات DNA اطمینان حاصل شود.

در نتیجه، PCR یک تکنیک همه کاره و قدرتمند است که امکان تکثیر توالی های DNA خاص را فراهم می کند. درک مراحل مختلف PCR برای طراحی آزمایش های کارآمد و موفق ضروری است. با بهینه سازی دقیق شرایطی مانند طراحی پرایمر، دمای آنلینگ و پارامترهای تکرار چرخه، محققان می توانند به نتایج دقیق و قابل تکرار در کاربردهای مختلف PCR دست یابند.