انتخاب آنتی بادی اولیه و آنتی بادی ثانویه

Doctor P

۸ تیر, ۱۴۰۰

بدون دیدگاه

3 دقیقه زمان مطالعه

انتخاب آنتی بادی اولیه و آنتی بادی ثانویه

انتخاب آنتی بادی اولیه یا آنتی بادی ثانویه

چگونه آنتی بادی اولیه یا ثانویه مناسب برای آزمایشات خود پیدا کنیم.

آنتی بادی های اولیه برای WB
آنتی بادی های اولیه برای IHC
آنتی بادی های اولیه برای رنگ آمیزی سلول

فهرست

ماهیت نمونه

ماهیت نمونه شما تعیین می کند که کدام آنتی بادی مناسب ترین است. جنبه های زیر را در نظر بگیرید:

منطقه ای از پروتئین که می خواهید تشخیص دهید

آنتی بادی ها با ایمن سازی حیوانات میزبان با ماده ایمنی زا تولید می شوند. ایمنی زا ها می توانند پروتئین هایی با طول کامل، قطعات پروتئینی، پپتیدها، ارگانیسم های کامل (به عنوان مثال ، باکتری ها) یا سلول ها باشند.

بررسی کنید که ایمونوژن با ناحیه پروتئینی که می خواهید آن را تشخیص دهید یکسان است یا در آن وجود دارد. به عنوان مثال، اگر می خواهید با استفاده از FACS پروتئین سطح سلول را روی سلولهای زنده تشخیص دهید، آنتی بادی را انتخاب کنید که در برابر دامین خارج سلولی پروتئین ایجاد شده باشد.

پردازش نمونه

برخی از آنتی بادی ها نیاز به تیمار به روشی خاص دارند. بسیاری از آنتی بادی ها فقط پروتئین های کاهش یافته و دناتوره شده را تشخیص می دهند، زیرا اپی توپ هایی را نشان می دهد که در غیر این صورت با تاشدن ثانویه و سوم پروتئین ها پنهان می شوند. از طرف دیگر، برخی از آنتی بادی ها فقط اپی توپ را در پروتئین ها در حالت بومی و چین خورده خود تشخیص می دهند. آنتی بادی های وسترن بلات نیاز به کاهش و دناتوره شدن نمونه ها دارد.

در ایمونوهیستوشیمی، برخی از آنتی بادی ها فقط برای بافت منجمد فیکس نشده مناسب هستند. سایر نمی توانند بدون گام بازیابی آنتی ژن که پیوندهای متقاطع معرفی شده توسط تثبیت فرمالین را برعکس می کند ، در بافتهای تعبیه شده در فرمالین و پارافین به اهداف خود متصل شوند. این محدودیت های استفاده در کاربردهای آنتی بادی ها قبل از انتخاب محصول باید بررسی شود.

گونه مورد استفاده نمونه

در صورت امکان، آنتی بادی را انتخاب کنید که در برابر همان گونه ای که نمونه شما از آن است، باشد. آنتی بادی ممکن است با همان پروتئین هدف از سایر گونه ها که دارای همسانی توالی اسیدهای آمینه هستند، واکنش نشان دهد. پیش بینی واکنش متقابل بر اساس تشابه توالی انجام می شود.

انتخاب گونه میزبان آنتی بادی اولیه

گونه هایی که آنتی بادی اولیه در آن پرورش می یابد باید با گونه های نمونه شما متفاوت باشد. این امر برای جلوگیری از واکنش متقابل آنتی بادی ضد ایمونوگلوبولین ثانویه با ایمونوگلوبولین های درون زا در نمونه است. به عنوان مثال ، اگر شما در حال مطالعه پروتئین موش هستید، یک آنتی بادی اصلی را انتخاب کنید که در گونه دیگری غیر از موش پرورش می یابد. یک آنتی بادی اولیه پرورش یافته در خرگوش یک انتخاب مناسب و به دنبال آن یک آنتی بادی ثانویه IgG ضد خرگوش است.

برای تکنیک های استفاده از نمونه هایی که حاوی ایمونوگلوبولین درون زا (IgG) نیستند، انتخاب گونه میزبان آنتی بادی اولیه کمتر حیاتی است. به عنوان مثال ، وسترن بلات یک محلول سلول است که انتظار نمی رود حاوی IgG باشد. با این حال ، مواد لایزت بافتی و مواد رویی رویش بافتی حاوی سرم حاوی ایمونوگلوبولین ها خواهد بود. IgG در لکه های وسترن نمونه های کاهش یافته و دناتوره شده به صورت باند 50 و 25 کیلو دالتونی مربوط به زنجیره های سنگین و سبک مولکول IgG ظاهر می شود.

انتخاب آنتی بادی ثانویه

آنتی بادی های ثانویه باید علیه گونه میزبان آنتی بادی اولیه ای که استفاده می کنید باشد. به عنوان مثال، اگر ماده اولیه شما یک نوع منوکلونال موشی است، به یک ثانویه ضد موش نیاز خواهید داشت.

راهنمای آنتی بادی ثانویه را از اینجا دریافت کنید.

انتخاب آنتی بادی برای رنگ آمیزی دوگانه

رنگ آمیزی ایمنی مضاعف از کشت سلول ها یا بافت ها ، نیاز به تولید آنتی بادی های اولیه در گونه های مختلف دارد و آنتی بادی های ثانویه یکی از گونه ها را به طور انحصاری تشخیص می دهند. برای حذف واکنش متقاطع، از میان آنتی بادی های ثانویه ضد Ig که از قبل جذب شده.در برابر ایمونوگلوبولین های سایر گونه ها هستند، انتخاب کنید.

راهنمای انتخاب کونژوگه را دریافت کنید

برچسب های فلوئوروکروم و کروموژن

برچسب ها برای تجسم وجود پروتئین هدف به آنتی بادی ها متصل می شوند. انتخاب برچسب به کاربرد آزمایشی شما بستگی دارد.

برچسب های فلورسنت وقتی در اثر نور یک طول موج خاص تحریک می شوند،.در دامنه بینایی نور ساطع می کنند.
برچسب های آنزیمی پراکسیداز ترب کوهی یا (HRP) و آلکالن فسفاتاز (AP).در صورت ترکیب با سوبسترای مناسب رسوب رنگی تشکیل می دهند.
آنتی بادی های بیوتینیله هنگامی که توسط یک آنزیم آویدین-بیوتین یا فلوروکروم دنبال می شود (که معمولاً به عنوان معرف ABC مخفف می شود) یا آویدین یا استرپتاویدین متصل به آنزیم یا فلوئورکروم برای تقویت سیگنال مفید هستند.

نمودار فلوروکروم دریافت کنید